Bu yöntem Gen Terapisi, Onkoliz ve Genetik Aşılama alanındaki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bugüne kadar klinik çalışmalarda en sık kullanılan vektör tipi olan adenovirüs gen transfer vektörlerinin vektör konaklarının etkileşimlerinin anlaşılmasını ve modüle edilmesini kolaylaştırır. Bu tekniğin en büyük avantajı, adenovirüs kapsulates özellikle seçilen pozisyonlarda son derece tanımlanmış bir şekilde ve değişken ölçüde basit kimya kullanılarak değiştirilebilir olmasıdır.
Vektör konak modifikasyonu sadece analiz edilemediği, aynı zamanda hasta odaklı bir şekilde modüle edilemediği için bu tekniğin sonuçları tedaviye kadar uzanır. Bu yöntem belirli vektör konak etkileşimleri hakkında bilgi sağlasa da, fareler gibi canlı organizmalardaki virüs parçacıklarının etiketlanması ve izlenmesi için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni gelen bireyler, her iki alanda da pratik bilgi gerektiren Viroloji ve Organik Kimya'nın eşsiz kombinasyonu ile mücadele edecektir.
Bu tekniğin özel gösterimi çok önemlidir, çünkü burada Organik Kimya'dan gelen metotlar, alana özgü elleçleme hileleri de dahil olmak üzere Hücre Biyolojisi ve Viroloji'den gelen metotlarla buluşmaktadır. Bu yordamı başlatmak için metin protokolünde belirtildiği gibi tüm arabellekleri hazırlayın. Yoğunluğunu kontrol etmek için her degrade arabellek bir mililitre tartın.
Tüm tamponları sterilize ettikten sonra, TCEP'in oksidasyonunu önlemek için TCEP içeren tamponları yaklaşık 30 saniye boyunca argon gazı ile ayrıştın. Şişeleri eriterken yoğuşmalı suyun birikmesini önlemek için, her biri silika jel boncuklardan oluşan bir yastıkla doldurulmuş daha büyük tüplerde katı toz kaplin moiety içeren şişeleri saklayın. Bu tüpleri kurutucuya yerleştirin.
Kurutucudaki havayı çıkarın ve argon gazıyla değiştirin. Sonra sıkıca her tüp kapatın ve silika jel boncuk ile daha büyük bir kap içine aktarın. Tüm tüpler transfer edildikten sonra, kabı kapatın.
Kullanıma hazır olana kadar kabı 80 derecede saklayın. Çözülmeye hazır olduğunuzda, bir desiccator silika boncuk bir tabaka içine konteyner yerleştirin. Kabın oda sıcaklığına yavaşça ısınmasını bekleyin ve sonra kabı açın.
Hücreler optimal sitopatik etkiye ulaştığında, plakaları kazıyarak ve süpernatant santrifüj tüplere aktararak onları toplamak. Hücre süspansiyonuna 400 kez G'yi 10 dakika döndürün. Daha sonra, 10 milimolar TCEP içeren Reklam tampon dört mililitre hücre pelet yeniden askıya ve steril bir 50 mililitretüp için ortaya çıkan çözüm aktarın.
Çözeltiyi sıvı nitrojenle dondurun ve 37 santigrat derecede bir su banyosunda eritin. Vektörü kurtarmak için bu donma çözülme döngüsünü üç kez tekrarlayın. Santrifüj 5000 G ve dört santigrat derece on dakika.
Santrifüj iki eşit Sezyum klorür adım gradients hazırlamaya başlamak için iki ultra santrifüj tüpler yola iken. Bu tüplerin her biri için alt faz üç mililitre ekleyin. Üst fazyüklemeden önce tüpteki alt fazın seviyesini işaretleyin.
Daha sonra üst fazın beş mililitresini alt faza dikkatlice istifleyin ve tüpün duvarları boyunca çok yavaş bir şekilde aşağı yaslayın. Degradeler hazırlandığında ve santrifüj tamamlandığında, numuneden süpernatant iki degradenin üzerine eşit olarak yüklenir. Her bir degrade tüpteki kalan boşluğu, tüpleri en üste kadar doldurmayı sağlamak için on milimolar TCEP içeren Ad-tampon ile doldurun.
Karşı ttüplerin ağırlığını sıfır ağırlık farkıyla ayarlayın. Ve santrifüj için değiştirmek 176000 kez G ve 4 derece santigrat iki saat için. Bundan sonra, bir stand için bir ultra santrifüj tüpleri düzeltmek için bir kelepçe kullanın.
Alt faz düzeyi etrafında ki alanı erişilebilir olarak işaretli bıraktığından emin olun. Kaz boyunlu lambayı tüpün üzerine yerleştirin. İşaretin etrafında, alt ve üst evreler arasındaki sınırda, ayrı bir bant görünür olmalıdır.
Tüpü bir iğneyle delin ve vektör bandını bir şırıngaya aspire edin. Toplanan vektör vironlarını 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli olan bağlantı alt katmanı miktarını hesaplayın. Daha sonra vektör çözeltisini uygun büyüklükte bir tüpe aktarın.
Ve kaplin bileşiklerstok çözeltisi hesaplanan miktarda. Oda sıcaklığında bir saat boyunca havai rotasyon ile hafifçe karıştırın. Ardından, Reklam arabelleği ekleyerek vektör çözeltisinin toplam hacmini altı mililitreye ayarlayın.
Metin protokolünde belirtildiği gibi ikinci bir Sezyum klorür bağlama adımı kullanarak tepkiverilmemiş bağlantı moiety gelen vektör arındırın. Tüpü iğneyle delin ve vektör bandını şırıngaya aspire edin. Toplanan vektörleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Her iki degrade tüpten elde edilen toplam 2,5 mililitreden azsa, Reklam arabelleği ekleyerek ses düzeyini 2,5 mililitreye ayarlayın. Birleştirilmiş vironları eşit yükseltilmiş Pd sütununa yükleyin ve akışı atın. Ardından sütuna üç mililitre Reklam arabelleği ekleyin ve akışı toplayın.
Yüzde on nihai konsantrasyonelde etmek için toplanan akış akıtmak için gliserol 333 mikrolitre ekleyin. Bunları uygun aliquots bölün. OD 260 ölçümü ile daha sıkı tayini için 20 mikrolitrelik bir aliquot eklenindiğinden emin olun.
Vektör çözeltisini kullanıma hazır olana kadar 80 santigrat derecede saklayın. 293 hücre üzerindeki etkilerin temsili sonuçları vektör üretiminin başarılı olduğunu göstermektedir. Hücreler virüs vektörü ile aşıedildikten 40-48 saat sonra morfoloji göstermelidir.
Gümüş lekeli SDS faj sonra kaplin verimliliğini değerlendirmek için kullanılır. Hem hexon modifiye edilmiş hem de değiştirilmemiş kapsomere pentone tabanına sistein ile getirilen vektörler çalıştırılır. Hexon bantları capsid başına monomerlerin yüzde 90'ından fazlasında başarılı bir değişiklik gösteren bir değişim sergilerler.
Bu yordamı denerken, modofied vektör parçacığı için bir azaltıcı ortam sağlamak önemlidir. Modifikasyondan sonra düzenli bir atmosfer uygundur. Hassas belgesel hesaplamalar tüm vektör parçacıklarının nicel modifikasyonsağlamak zorunda.
Bu tekniğin geliştirilmesi daha fazla vektör teslim için güvenli ve eksik stratejileri keşfetmek için Gen Terapisi alanında araştırma yardımcı olur. Bu prosedürütaki gibi diğer yöntemler inetiketleme için hedefleme veya floresan boyalar için ligands kaplin gibi diğer yöntemler reseptör kullanımı ve biyo dağıtım gibi ek sorulara cevap vermek için yapılabilir. Lütfen yerel GDO ve İş Güvenliği Yönetmeliklerine uyduğunuzdan emin olun.
