Los portadores de fármacos poliméricos catiónicos tienen las ventajas de una buena estabilidad, baja inmunogenicidad y preparación y modificación fáciles. Aquí, ofrecemos un método rápido y simple para su síntesis. El método de polimerización de transferencia de cadena de fragmentación reversible es un método aplicable a polímeros de bloque de rendimiento con peso molecular controlado y estructura y grupos funcionales de transporte.
Estos portadores de fármacos pueden llevar simultáneamente diferentes medicamentos para lograr el tratamiento de la colaboración del cáncer, la inflamación y otras enfermedades. La polimerización IFT es un método clásico, y este protocolo da un ejemplo de su aplicación en la terapia génica. La clave del éxito para la síntesis de este polímero es controlar con precisión la temperatura de reacción.
Es más aconsejable utilizar un baño de aceite que un baño de agua. Para comenzar este procedimiento, obtenga un matraz de fondo redondo con un tapón de goma y un agitador magnético que se utilizará como botella de polimerización. Disolver 1,87 gramos de BIS-hidroxi HEMA en un mililitro de agua destilada en la botella de polimerización.
En un vaso de precipitados de cinco mililitros, disolver 0,03 gramos de CTP y 0,02 gramos de ACVA en 0,5 mililitros de 1, 4-dioxano. Añadir esta mezcla a la botella de polimerización. A continuación, utilice una trampa de condensado para congelar la solución en la botella de polimerización.
Fije el frasco al soporte de hierro y utilice un conducto tropezado con una aguja para aspirar e inyectar nitrógeno en la mezcla de reacción. A continuación, selle la botella de polimerización y descongele la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos. Repita este ciclo de congelación-bomba-descongelación tres veces.
Después de esto, coloque la botella en un baño de aceite a 70 grados centígrados y deje que la solución reaccione durante 24 horas bajo la atmósfera de nitrógeno. Al día siguiente, enfríe la botella de polimerización a cero grados Celsius y abra el tapón de goma para terminar la reacción de polimerización. A continuación, preenfriar la acetona en un refrigerador a 20 grados Celsius negativos durante dos horas, y mezclarlo con la solución de reacción en la botella de polimerización en una proporción de 50 a uno.
Centrifugar esta mezcla a 8.200 veces g durante 10 minutos para eliminar la acetona y recoger el precipitado. Para purificar el heMA de poli bishidy sintetizado, disolver el precipitado recogido en dos mililitros de agua pura. Luego, mezcle con 100 mililitros de acetona preenfriada en una proporción de uno a 50.
Centrifugar la solución a 8.200 veces g durante 10 minutos para recoger el precipitado. Repita este proceso de purificación de disolver, mezclar y centrifugar el precipitado tres veces. En primer lugar, disolver 0,96 gramos de APMA y 0,93 gramos del HEMA poli bishidróxi purificado en cinco mililitros de agua destilada en un vaso de precipitados de 10 mililitros.
Disolver 0,01 gramos de ACVA en 0,5 mililitros de 1, 4-dioxano, y añadirlo a la solución APMA y poli bishidróxi HEMA. Transfiera esta mezcla a una botella de polimerización y ventile con nitrógeno seco durante una hora. Luego, coloque la botella de polimerización en un baño de aceite a 70 grados centígrados, y deje que reaccione durante 24 horas bajo la atmósfera de nitrógeno.
Al día siguiente, enfríe la botella de polimerización a cero grados Celsius y abra el tapón de goma para terminar la solución del proceso de polimerización. Para empezar, siembra células MCF-7 en los pozos de una placa de seis pozos a una densidad de 20.000 células por pozo. Cultivo de las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 12 horas.
Después de esto, reemplace el medio de cultivo con el medio de cultivo fresco que contiene polímero catiónico y poliplexios poliplexes de pDNA de diferente proporción de relaciones nitrógeno-fósforo. Escarúrlas durante seis horas, y luego reemplace el medio con dos mililitros de rpm 1640 medio fresco. Continúe cultivando durante 48 horas.
Luego, recoja las células y utilice un citómetro de flujo para detectar la fluorescencia verde. En este estudio, los copolímeros de bloques biocompatibles funcionalizados por metionina se preparan a través del método de transferencia de cadena de fragmentación de adición reversible, y se investiga la capacidad de complejo de ADN plásmido del mBG obtenido y su eficiencia de transfección. El tamaño medio de partícula y el potencial zeta de los poliplexes mBG/pDNA son 124 nanómetros y más 15,7 milivoltios, respectivamente, con una relación N-P de 16.
El retardo electroforético revela que el pDNA con una relación N-P de cero puede moverse sin restricciones en el gel de agarosa y se observa como una raya en el imágenes de gel. Cuando el pDNA se compleja con mBG, el movimiento de pDNA se retrasa, y posteriormente, el brillo de la banda se reduce. Esto muestra que el mBG puede complejo completamente el pDNA cuando el N a P es más alto que cuatro.
La citotoxicidad de los poliplexes mBG/pDNA se mide utilizando el ensayo estándar de MTT Estos resultados muestran que los poliplexes mBG/pDNA tienen citotoxicidad que los poliplexes PEI/pDNA en las relaciones N-a-P de cuatro, ocho, 16 y 32. Como también se puede ver, la citotoxicidad de los poliplexes mBG/pDNA aumenta con una mayor relación N-P. Este aumento de la citotoxicidad es el resultado del componente GPMA cargado positivamente.
La relación N-P utilizada en el experimento de transfección de ADNF se selecciona de acuerdo con los resultados de la citotoxicidad. Las capacidades de transfección de mBG1, mBG2 y mBG3 se comparan midiendo la intensidad de fluorescencia GFP, y los resultados mostraron que mBG3 es el portador de genes óptimo. Es importante agotar el aire del matraz de fondo redondo del limo y mantener la temperatura de reacción.
Los portadores de fármacos de polímeros obtenidos se pueden aplicar a la co-entrega de medicamentos de quimioterapia y medicamentos genéticos para tratar sinérgicamente el cáncer farmacorresistente. El mecanismo molecular de la combinación de fármacos genéticos y medicamentos quimioterápticos se puede explorar más a fondo para el tratamiento de tumores farmacorresistentes. La acetona se clasifica como baja tóxica por su toxicidad aguda.
Deben evitarse las llaves, la inhalación o el contacto con los ojos o la piel. Evitar el riesgo de escaldación durante el procedimiento de calentamiento.
