El protocolo actual es significativo porque permite a los investigadores producir nanopartículas cargadas de siRNA, y caracterizar adecuadamente estas nanopartículas para asegurar su idoneidad para la administración a los animales antes de estudios posteriores. La ventaja de este enfoque es producir nanopartículas que aumenten la biodisponibilidad del ARNr y producir nanopartículas que estén cargadas de forma neutra y, por lo tanto, adecuadas para la administración sistémica. Esta técnica es impactante porque las nanopartículas de siRNA se pueden aplicar para tratar una miríada de enfermedades que requieren administración sistémica, incluyendo cáncer, enfermedades cardiovasculares y trastornos autoinmunes, entre otros.
Para empezar, disolver el polímero en etanol a una concentración de 33,3 miligramos por mililitro y agitar para asegurar la disolución. A continuación, utilice una pipeta para transferir la solución de polímero en 10 tampón de ácido cítrico milimolar para alcanzar una concentración de 3,33 miligramos por mililitro. Añadir agua destilada en un tubo que contenga un pequeño ARN interferente para lograr una concentración de 50 micromolares.
Mezcle bien el polímero y las pequeñas soluciones de ARN que interfieren en un tubo pipeteando hacia arriba y hacia abajo para lograr una relación nitrógeno a fosfato de 10. Coloque el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, agregue un mililitro de tampón de fosfato milimotora a pH ocho al tubo para lograr una concentración de 0,28 miligramos por mililitro y mezcle suavemente ya sea pipeteando o invirtiendo el tubo.
Para confirmar que el pH final es neutro, alrededor de 7,2 a 7,5, pipetear 10 microlitros de la pequeña solución de nanopartículas de ARN interferente en las tiras reactivas de pH. En primer lugar, preparar una muestra dinámica de dispersión de luz filtrando un mililitro de pequeñas nanopartículas de ARN interferente a la concentración de 0,28 miligramos por mililitro a través de filtros de jeringa de poro de 0,45 micrómetros en una cubeta de cuarzo cuadrado o poliestireno. A continuación, registre las mediciones de tamaño y carga de superficie utilizando un instrumento de dispersión de luz dinámico de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Para confirmar el tamaño y la morfología de pequeñas nanopartículas de ARN que interfieren utilizando microscopía electrónica de transmisión, agregue primero cinco microlitros de solución filtrada de nanopartículas de ARN interferente a 0,28 miligramos por mililitro a cada cuadrícula TEM. Coloque las rejillas a temperatura ambiente durante 60 segundos. Seque con papel de filtro durante tres segundos.
A continuación, añadir cinco microlitros de 3%solución de acetato de uranilo a cada rejilla e incubar durante 20 segundos. Seque durante tres segundos. A continuación, coloque las rejillas en un desecador para secar durante la noche antes de tomar imágenes bajo microscopía electrónica de transmisión.
Para realizar el retardo del gel de agarosa, primero agregue dos gramos de polvo de agarosa de grado electroforesis a 100 mililitros de tampón 1X Tris-acetate-EDTA a pH ocho en un vaso de precipitados para producir un 2% de gel de agarosa. Revuelva para suspender la agarosa. Coloque el vaso de precipitados sin tapar en un microondas para calentar durante uno a tres minutos hasta que se disuelva toda la agarosa.
Una vez enfriado, añadir cinco microlitros de bromuro de etidio a la concentración de 10 miligramos por mililitro en el vaso de precipitados y mezclar bien. Luego vierta la agarosa en una bandeja de gel y coloque el peine para producir pozos. Deje secar el gel durante 30 minutos.
Retire cuidadosamente el peine para dejar atrás los pozos de carga, y vierta 1X tampón Tris-acetate-EDTA en la bandeja de gel para llenar hasta la línea de llenado máximo. A continuación, coloque dos alícuotas microlitros de tinte de carga sin SDS o agentes reductores en la película de parafina para cada pequeña formulación de nanopartículas de ARN interferente en diferentes proporciones de nitrógeno a fosfato. Pipeta para mezclar 10 microlitros de pequeña solución de nanopartícula de ARN interferente con tinte de carga en película de parafina.
Añadir la mezcla a los pozos de gel de agarosa. Enchufe el sistema de electroforesis a una fuente de alimentación y ejecute una fuente de tensión a 100 voltios durante 35 minutos o hasta que las muestras hayan atravesado el 80% de la longitud del gel. Transfiera el gel de la bandeja a un transilluminador UV y visualice las pequeñas bandas de ARN que interfieren en el transilluminador UV de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Determinar la relación óptima de nitrógeno a fosfato basado en la desaparición de pequeñas bandas de ARN que interfieren en la parte inferior del gel. Para derribar el gen modelo de luciferasa, las primeras células que expresan la luciferasa de semillas en una placa de pared negra de 96 pozos con DMEM en 10%FBS a una densidad de 2.000 células por pozo. Coloque la placa en una incubadora durante la noche para permitir que las células se adhieran.
Por la mañana, retire los medios y añada 10 microlitros por pozo de nanopartículas de ARN que interfieren pequeñas diluidas en medios séricos completos para una concentración final de ARN interferente pequeño de 100 nanomolares. Devuelva los pozos a la incubadora durante 24 horas para tratar las células con pequeñas nanopartículas de ARN que interfieren. Al día siguiente, reemplace los medios con medios séricos completos que contengan 150 microgramos por mililitro D-luciferina.
Incubar las células a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de medir la luminiscencia en un lector de placas. A continuación, repita el refresco de medios dos veces con medios séricos completos frescos libres de D-luciferina, seguido de incubación durante 24 horas. Sustituya el medio con un medio sérico completo que contenga 150 miligramos por mililitro de D-luciferina e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Mida la luminiscencia en el punto de tiempo de 48 horas. Para estudios longitudinales, deje la tapa en la parte superior de la placa del pozo cuando esté fuera del gabinete de bioseguridad para mantener las células en condiciones estériles y continuar la incubación después de reemplazar los medios que contienen luciferina por medios completos frescos. Las mediciones dinámicas de dispersión de luz muestran que una pequeña nanopartícula de ARN que interfiere tiene un diámetro promedio de 35 nanómetros.
La presencia de un único pico con anchura de pico estrecha indica una distribución unimodal y baja polidispersidad. Las mediciones TEM confirman que la medición del tamaño de la dispersión dinámica de la luz sugiere la presencia de una población uniforme de pequeñas nanopartículas de ARN que interfieren y revelan la morfología esférica de las pequeñas nanopartículas de ARN que interfieren. La concentración demasiado alta de polímero en el paso de preparación dio lugar a pequeñas nanopartículas de ARN interferentes dos en diámetro indeseable de más de 200 nanómetros, una población multimodal y polidispersada, y agregados en solución que no forman morfología de partículas distintas.
Ambas pequeñas nanopartículas de ARN interferentes una y dos muestran una carga de superficie neutra indicada por valores potenciales zeta medios cercanos a cero. El ensayo de retardo del gel de agarosa muestra la desaparición de pequeñas bandas de ARN que interfieren en el fondo del gel, lo que indica la complejidad del ARN que interfiere pequeño al polímero. El ARN pequeño que interfiere con el polímero es incapaz de migrar a través del gel y por lo tanto se visualiza en la parte superior del gel cercano a los pozos de carga.
A medida que se aumenta la relación nitrógeno-fosfato, la complejidad del ARN interferente pequeño aumenta según lo indicado por la disminución de la intensidad de la pequeña banda de ARN interferente en el fondo del gel. Bioactive luciferase pequeña nanopartícula de ARN interferente se presenta una actividad luciferasa significativamente disminuida en comparación con el control revuelto. Por el contrario, la luciferasa pequeña nanopartícula de ARN interferente dos no se considera bioactiva.
Para producir nanopartículas de siRNA consistentes con las propiedades fisicoquímicas deseadas, se deben utilizar soluciones de polímeros con concentraciones adecuadas y validar el pH de las soluciones tampón en cada paso del protocolo. Usando estos métodos en nuestra investigación hemos sido capaces de producir terapias basadas en nanopartículas de siRNA para genes que causan cáncer antes no intercambiables y probar la eficacia de estas terapias en modelos preclínicos de cáncer de mama.
