Este protocolo describe cómo aplicar una metodología preestirigida a la radioterapia dirigida de xenogramas de cáncer en el modelo de ratón. La radioinmunoterapia precalentada o PRIT nos permite inyectar el anticuerpo y radioligand por separado, y dejar que los dos combinen in vivo usando la química de clics. Mientras presentamos PRIT utilizando un modelo de xenografía de cáncer colorrectal, esta técnica se puede aplicar a cualquier anticuerpo de objetivo de antígeno superficial.
Es importante seleccionar un antígeno que no se internalice rápidamente o se desborde extensamente, ya que estos pueden reducir la eficacia del enfoque. Para sintetizar huA33-TCO primero prepare una solución de 125 microlitros de 40 miligramos por mililitro TCO-NHS en metilformamida seca en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Esta solución se puede alicuar y congelar a 80 grados centígrados para su uso en experimentos futuros.
En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros separado, prepare una solución de cinco miligramos por mililitro de huA33 en un mililitro de solución salina tamponada con fosfato. Con pequeñas alícuotas de carbonato sódico molar 0,1, ajuste el pH de la solución de anticuerpos a entre 8,8 y 9,0. Utilice papel de pH o un medidor de pH con un microelectrodo para controlar el pH, y tenga cuidado de que el pH no exceda de 9,0.
Añadir un volumen correspondiente a 40 equivalencia molar de TCO-NHS a la solución de anticuerpos. Para evitar la precipitación del TCO-NHS hidrófobo, agréguelo lentamente y con agitación. Deje que la reacción se incuba a 25 grados centígrados en un mezclador térmico durante una hora con agitación leve.
Antes de purificar el inmunoconjugado huA33-TCO utilizando una columna de desaladora de exclusión de tamaño desechable preenvasada, equilibre la columna de exclusión de tamaño según lo descrito por el proveedor para eliminar los conservantes presentes en la columna durante el almacenamiento, lo que normalmente implica lavar la columna cinco veces con un volumen de PBS que corresponde al volumen de la columna. Añadir la mezcla de reacción a la columna de exclusión de tamaño, observando el volumen de la mezcla de reacción. Después de que la mezcla de reacción ha entrado en la columna añadir una cantidad adecuada de PBS para llevar el volumen total de solución añadido a la columna hasta 2,5 mililitros.
Recoger el producto utilizando dos mililitros de PBS como eluyente. Mida la concentración del huA33-TCO utilizando un espectrofotómetro UV vis que monitorea la longitud de onda a 280 nanómetros. Si se desea una solución con una mayor concentración de inmunoconjugado, concentre la solución huA33-TCO utilizando una unidad de filtro centrífugo con un corte de peso molecular de 50.000 siguiendo las instrucciones del fabricante.
Almacene el inmunoconjugado huA33-TCO completado en 4 grados centígrados en la oscuridad. Si se va a utilizar más de cuatro días en el futuro almacenarlo a 80 grados centígrados en la oscuridad. En un tubo centrífugo de 1,7 mililitros añadir 200 microlitros de 0,25 tampón de acetato de amonio molar ajustado a pH 5,5.
Agregue la cantidad deseada de cloruro de lutecio-177 a la solución tampón. La cantidad añadida dependerá del número de sujetos en el experimento y de las dosis radiactivas que se administren. Añadir Tetrazine PEG7-DOTA en DMSO a la mezcla radiactiva.
La cantidad añadida depende del número de sujetos que se están probando. Deje que la solución se incuba a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Verifique que el radioetiquetado esté completo utilizando cromatografía de capa fina radio instantánea con 50 pH EDTA milimétricas 5.5 como fase móvil.
El Lutecio-177-DOTA-PEG7-Tetrazine etiquetado permanecerá en la línea de base, mientras que el Lutecio-177 libre será coordinado por la EDTA y viajará con el frente del disolvente. Es fundamental que la colocación de los tumores subcutáneos no interfiera con la técnica de restricción. Recomiendo colocarlos en el lado del flanco que es opuesto a su mano de sujeción.
Desde que me retendo con la mano izquierda he elegido colocar los tumores en el flanco derecho. Ordene los ratones desnudos athímicos femeninos con xenografía por cáncer colorrectal, de modo que el volumen tumoral promedio en cada cohorte sea aproximadamente igual. Para ello, enumere los números de identificación de los animales, el patrón de muesca y el volumen del tumor en tres columnas separadas de un programa de hoja de cálculo.
Ordene los datos del volumen tumoral más pequeño a el más grande. En una cuarta columna asigne a cada animal un número de jaula. Recorre las jaulas en un patrón similar a una serpiente hasta que a todos los animales se les asigne una jaula.
Una vez que se asignan a las jaulas, ordene los datos por número de jaula. Para inyectar las dosis de extracción inmunoconjugada de 150 microlitros de solución huA33-TCO en jeringas pretratadas con 1%albúmina sérica bovina en PBS, y almacenar estas jeringas en hielo. Para inyectar la radioligand, primero dibuje dosis en 150 microlitros de 0.9%salina estéril que contenga 1.1 equivalencia molar de la Tetrazine-PEG7-DOTA radiomarcada en relación con la cantidad de huA33-TCO administrada.
Utilice pinzas para medir el lado más largo del tumor oblongo, así como el ancho perpendicular a la longitud. Pesar cada ratón en una balanza para realizar un seguimiento del aumento de peso o pérdida de peso con el tiempo. Por último, calcule el volumen utilizando la fórmula para el volumen de un elipsoide suponiendo que la altura es aproximadamente igual a la anchura.
Aquí se muestra la biodistribución de una pretargeting in vivo con huA33-TCO y Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine en ratones desnudos athímicos que llevan tumores de caña colorrectáneos en humanos SW1222. Todos los intervalos de inyección producen altas concentraciones de actividad en el tejido tumoral, así como bajas concentraciones de actividad en órganos sanos. El intervalo de inyección de 24 horas ofrece la mayor absorción tumoral a las 120 horas después de la inyección.
Sobre la base de estos hallazgos se eligió un intervalo de 24 horas para el posterior estudio de terapia longitudinal. Aquí se muestra un estudio de terapia longitudinal de cinco grupos de ratones con tumores SUBcutáneos SW1222 representados en el volumen tumoral promedio en función del tiempo, y el volumen tumoral normalizado al volumen inicial en función del tiempo. Hay una marcada diferencia en la respuesta de las cohortes experimentales en comparación con los grupos de control.
Mientras que los tumores en los ratones que recibieron sólo un componente de la estrategia de radioinmunoterapia pretargeted continuaron creciendo sin control, los tumores de los ratones que recibieron el régimen completo de radioinmunoterapia precalentado dejaron de crecer y, en última instancia, se redujeron. Es importante destacar que no se observaron efectos secundarios tóxicos, y todos los animales mantuvieron un peso dentro del 20% de su masa inicial. Sorprendentemente, los ratones de las cohortes experimentales tenían un registro perfecto de supervivencia al final de la investigación.
Al intentar este procedimiento es de suma importancia medir con precisión y reproducibilidad los tumores. Cuando trabaje con radiactividad, consulte al oficial de seguridad radiológica de su institución para desarrollar protocolos e instalaciones seguras. Tener controles de seguridad adecuados en su lugar limitará su exposición y evitará la contaminación.
La pretargeting proporciona una dosis de radiación más baja a los órganos de fondo que la radioinmunoterapia tradicional. Al compartir este protocolo esperamos que otros puedan probar sus propios modelos e ideas que conducirán a nuevos y emocionantes avances para el tratamiento del paciente.
