Этот протокол описывает, как применить предцеленую методологию к целевой лучевой терапии раковых ксенографов в модели мыши. Претаргетированная радиоиммунотерапия или PRIT позволяет вводить антитела и радиолиганд отдельно, и пусть два объединить in vivo с помощью нажмите химии. В то время как мы представляем PRIT с помощью ксенографной модели колоректального рака, этот метод может быть применен к любому поверхностного антигена, нацеленного на антитела.
Важно выбрать антиген, который не интернализировать быстро или пролить широко, поскольку они могут снизить эффективность подхода. Для синтеза huA33-TCO сначала приготовьте 125 микролитровый раствор по 40 миллиграммов на миллилитр TCO-NHS в сухом метилформамиде в микроцентрифугной трубке 1,7 миллилитров. Это решение может быть aliquoted и заморожены при 80 градусов по Цельсию для использования в будущих экспериментах.
В отдельной 1,7 миллилитровой микроцентрифуге трубки подготовить пять миллиграмм на миллилитр раствор huA33 в одном миллилитре фосфата буфера солевого раствора. Используя небольшие алициты 0,1 молярного карбоната натрия, отрегулируйте рН раствора антитела до 8,8-9,0. Используйте либо рН бумаги или рН метр с микроэлектрода для мониторинга рН, и проявлять осторожность, что рН не превышает 9,0.
Добавьте объем, соответствующий 40 молярной эквивалентности TCO-NHS к раствору антител. Для предотвращения осадков гидрофобных ТШО-ГСЗ, добавить его медленно и с волнением. Разрешить реакцию инкубировать при 25 градусах по Цельсию на тепловом миксере в течение одного часа с легким возбуждением.
Перед очисткой huA33-TCO иммуноконъюгации с помощью предварительно упакованных одноразовых размеров исключения опреснения колонки, уравнять столбец исключения размера, как описано поставщиком, чтобы удалить любые консерванты, присутствующие в колонке во время хранения, который обычно включает в себя мытье столбца пять раз с объемом PBS, что соответствует объему колонки. Добавьте смесь реакции в столбец исключения размера, увезрения объема реакционной смеси. После того, как смесь реакции вошла в столбец, добавьте соответствующее количество PBS, чтобы довести общий объем раствора, добавленного в столбец, до 2,5 миллилитров.
Соберите продукт с помощью двух миллилитров PBS в качестве элюента. Измерьте концентрацию huA33-TCO с помощью УФ-спектрофотометра, отслеживая длину волны на 280 нанометров. Если решение с более высокой концентрацией иммуноконъюгации желательно концентрат huA33-TCO решение с использованием центробежного фильтра единицы с 50000 молекулярных отсечения веса в соответствии с инструкциями производителя.
Храните завершенный иммуноконъюгнит huA33-TCO при 4 градусах цельсия в темноте. Если он будет использоваться более четырех дней в будущем хранить его при 80 градусов по Цельсию в темноте. В 1,7 миллилитров центрифуги трубки добавить 200 микролитров 0,25 ацетата аммония буфера, скорректированного на рН 5,5.
Добавьте нужное количество хлорида лютеция-177 в буферный раствор. Добавленная сумма будет зависеть от количества испытуемых в эксперименте и вводимых радиоактивных доз. Добавьте Tetrazine PEG7-DOTA в DMSO в радиоактивную смесь.
Добавленная сумма зависит от количества испытуемых, которые проходят тестирование. Разрешить раствор инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Убедитесь, что радиолабелка завершена с помощью радио-мгновенно-тонко-слойной хроматографии с 50 миллимолярем EDTA pH 5.5 в качестве мобильной фазы.
Помеченный Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine останется на базовом уровне, в то время как бесплатный Lutetium-177 будет координироваться EDTA и путешествовать с растворителем фронта. Очень важно, чтобы размещение подкожных опухолей не мешало вашей технике сдерживания. Я рекомендую разместить их на фланговой стороне, которая противоположна вашей удерживаемой руке.
Так как я сдерживаю левой рукой, я решил разместить опухоли на правом фланге. Сортируют самок атимических обнаженных мышей с колоректальным раком ксенографа, так что средний объем опухоли в каждой когорте примерно равен. Для этого перечислите идентификационные номера животных, узор выемки уха и объем опухоли в трех отдельных столбцах программы электронной таблицы.
Сортив данные от самого маленького до самого большого объема опухоли. В четвертой колонке назначьте каждому животному номер клетки. Цикл через клетки в змеи, как картина, пока все животные назначены клетки.
После того, как клетки назначены сортировать данные по номеру клетки. Для введения иммуноконъюгации нарисуйте дозы 150 микролитров раствора huA33-TCO в шприцах, предварительно обработавающих 1%бычьим альбумином сыворотки в PBS, и храните эти шприцы на льду. Чтобы ввести радиолиганд, сначала нарисуйте дозы в 150 микролитров 0,9%стерильного солевого раствора, содержащего 1,1 молярную эквивалентность радиомаркированного тетразина-PEG7-DOTA относительно количества вводимого huA33-TCO.
Используйте калиперы для измерения самой длинной стороны продолговатой опухоли, а также ширины, которая перпендикулярно длине. Взвешивайте каждую мышь на балансе, чтобы отслеживать увеличение веса или потерю веса с течением времени. Наконец, вычислите объем, используя формулу для объема эллипсоида, предполагая, что высота примерно равна ширине.
Здесь показана биораспределение претаргетинга in vivo с huA33-TCO и Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine у атимических обнаженных мышей с подкожными опухолями колоректального канера SW1222 человека. Все интервалы инъекций производят высокую концентрацию активности в опухолевой ткани, а также низкие концентрации активности в здоровых органах. 24-часовой интервал инъекций обеспечивает самое высокое уровень поглощения опухоли при 120 часах после инъекции.
На основе этих выводов был выбран 24-часовой интервал для последующего исследования продольной терапии. Здесь показано продольное терапевтиза исследования пяти групп мышей, несущих подкожные опухоли SW1222, изображенные в среднем объеме опухоли как функция времени, а объем опухоли нормализуется до первоначального объема в качестве функции времени. Существует резкое различие в реакции экспериментальных когорт по сравнению с контрольных групп.
В то время как опухоли у мышей, получающих только один компонент стратегии претаргетной радиоиммунотерапии, продолжали расти бесконтрольно, опухоли мышей, получающих полный преднацеленый режим радиоиммунотерапии, перестали расти и в конечном счете сократились. Важно отметить, что никаких токсических побочных эффектов не наблюдалось, и все животные поддерживали вес в пределах 20% от их первоначальной массы. Поразительно, но мыши экспериментальных когорт имели идеальный послужной список выживания в конце исследования.
При попытке этой процедуры крайне важно точно и воспроизводимо измерять опухоли. При работе с радиоактивностью проконсультируйтесь с сотрудником службы радиационной безопасности вашего учреждения для разработки безопасных протоколов и объектов. Наличие надлежащего контроля безопасности на месте ограничит ваше воздействие и избежать загрязнения.
Претаргетирование обеспечивает более низкую дозу облучения фоновых органов, чем традиционная радиоиммунотерапия. Делясь этим протоколом, мы надеемся, что другие смогут протестировать свои собственные модели и идеи, которые приведут к новым и захватывающим достижениям в лечении пациентов.
