이 프로토콜은 마우스 모델에서 암 제노그래프의 표적 방사선 요법에 사전 표적 방법론을 적용하는 방법을 설명합니다. 사전 표적 방사성 면역 요법 또는 PRIT는 항체와 방사성 리간간드를 별도로 주입할 수 있게 해주며, 두 가지가 클릭 화학을 사용하여 생체내에서 결합할 수 있게 한다. 우리는 대장암의 xenograph 모형을 사용하여 PRIT를 제출하는 동안, 이 기술은 항체를 표적으로 하는 어떤 표면 항원든지에 적용될 수 있습니다.
이러한 접근의 효능을 줄일 수 있기 때문에 빠르게 내면화하거나 광범위하게 흘리지 않는 항원을 선택하는 것이 중요합니다. huA33-TCO를 합성하기 위해 먼저 1.7 밀리리터 미세 센심분리기 튜브에서 건조 메틸포르마미드에서 밀리리터 TCO-NHS당 40 밀리그램의 125 마이크로리터 용액을 준비한다. 이 솔루션은 향후 실험에서 사용하기 위해 80도에서 알리인용 및 냉동될 수 있습니다.
별도의 1.7 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 인산염 완충식 식염수 의 1 밀리리터에 huA33의 밀리리터 용액 당 5 밀리그램을 준비합니다. 탄산나트륨 0.1의 작은 알리쿼트를 사용하여 항체 용액의 pH를 8.8에서 9.0 사이로 조절한다. pH를 모니터링하기 위해 마이크로 전극을 가진 pH 용지 또는 pH 미터를 사용하고 pH가 9.0을 초과하지 않는 운동 관리를 사용합니다.
항체 용액에 TCO-NHS의 40대 어금화에 상응하는 부피를 추가한다. 소수성 TCO-NHS의 강수량을 방지하려면 천천히 동요로 추가하십시오. 가벼운 동요와 함께 1 시간 동안 열 믹서에 섭씨 25도에서 배양하는 반응을 허용합니다.
huA33-TCO 면역콘주게이트를 미리 포장된 일회용 크기 배제 탈염 컬럼을 사용하여 정화하기 전에, 일반적으로 열의 부피에 해당하는 PBS의 부피로 열을 5회 세척하는 것을 포함하는 저장 중에 컬럼에 존재하는 방부제를 제거하기 위해 공급업체가 설명한 바와 같이 크기 배제 열을 평형화한다. 반응 혼합물의 부피를 지적하고, 크기 배제 컬럼에 반응 혼합물을 추가합니다. 반응 혼합물이 컬럼에 들어간 후 적절한 양의 PBS를 추가하여 컬럼에 최대 2.5 밀리리터를 첨가한다.
PBS의 두 밀리리터를 용으로 사용하여 제품을 수집합니다. 280 나노미터에서 파장을 모니터링하는 UV 비스 분광계를 사용하여 huA33-TCO의 농도를 측정합니다. 면역콘주게이트의 농도가 높은 용액이 바람직한 경우, 제조자의 지시에 따라 50, 000 분자량 차단을 가진 원심 필터 장치를 이용하여 huA33-TCO 용액을 농축한다.
완성된 huA33-TCO 면역콘주게이트를 어둠 속에서 섭씨 4도에 보관하십시오. 그것은 미래에 4 일 이상 사용 하는 경우 어둠 속에서 섭씨 80도에 저장 합니다. 1.7 밀리리터 원심분리기 튜브에서 pH 5.5로 조정된 0.25 개의 어금니 암모늄 아세테이트 버퍼의 200 마이크로리터를 첨가합니다.
완충액에 원하는 양의 루테튬-177 염화물을 넣습니다. 추가된 양은 실험에서 피험자의 수에 따라 달라지며, 투여중인 방사성 투여량이다. 방사성 혼합물에 DMSO에 테트라진 PEG7-DOTA를 추가합니다.
추가된 금액은 테스트 중인 피험자의 수에 따라 다릅니다. 용액이 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하도록 허용하십시오. 무선 인스턴트 씬 층 크로마토그래피를 사용하여 50 밀리머러 EDTA pH 5.5를 모바일 단계로 사용하여 방사성 라벨링이 완료되었는지 확인합니다.
표기된 루테튬-177-DOTA-PEG7-Tetrazine은 기준선에 남아 있으며, 무료 루테튬-177은 EDTA에 의해 조정되고 용매 전면과 함께 여행할 것입니다. 피하 종양의 배치가 구속 기술을 방해하지 않는 것이 중요합니다. 나는 당신의 억제 손과 반대 측면 측면에 배치하는 것이 좋습니다.
왼손으로 제지했기 때문에 나는 종양을 오른쪽 측면에 배치하기로 결정했습니다. 각 코호트의 평균 종양 부피가 대략 동일할 수 있도록 대장암 xenograph를 가진 여성 athymic 누드 마우스를 정렬합니다. 이렇게 하려면, 스프레드시트 프로그램의 세 개의 별도 컬럼에 동물 식별 번호, 귀 노치 패턴 및 종양 볼륨을 나열합니다.
가장 작은 종양 부피에서 가장 큰 종양 부피로 데이터를 정렬합니다. 네 번째 열에서 각 동물에게 케이지 번호를 할당합니다. 모든 동물이 케이지를 할당 할 때까지 뱀모양의 패턴으로 케이지를 순환합니다.
케이지가 할당되면 케이지 번호로 데이터를 정렬합니다. PBS에서 1%소 세럼 알부민으로 전처리된 주사기에 huA33-TCO 용액의 150마이크로리터의 면역콘주게이트 를 주입하고, 이러한 주사기를 얼음에 저장한다. 방사성리간드를 주입하기 위해, 먼저 150 마이크로리터에서 0.9%의 멸균 식염수를 유도하여 1.1개의 용해성 포름을 함유하고 있으며, 이는 투여된 huA33-TCO의 양에 비해, 체트라진-PEG7-DOTA의 양에 비해.
캘리퍼를 사용하여 직사각형 종양의 가장 긴 측면과 길이에 수직인 폭을 측정합니다. 시간이 지남에 따라 체중 증가 또는 체중 감소를 추적 하는 균형에 각 마우스무게. 마지막으로 높이가 너비와 거의 같다고 가정하면 타원체의 부피에 대한 수식을 사용하여 볼륨을 계산합니다.
여기에 표시된 생체 내 생체 분포는 huA33-TCO 및 Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine을 함유한 아티믹 누드 마우스에서 피하 SW1222 인간 대장 캐너 종양을 베어링하는 생체 내 사전 타겟팅이다. 모든 사출 간격은 건강한 장기에서 낮은 활동 농도뿐만 아니라 종양 조직에서 높은 활동 농도를 생성합니다. 24 시간 주입 간격은 120 시간 후 주입에서 가장 높은 종양 섭취를 제공 합니다.
이러한 연구 결과에 기초하여 24 시간 간격은 후속 종로 치료 연구를 위해 선택되었다. 여기에 도시된 피하 SW1222 종양을 베어링 마우스의 5개 그룹의 종방향 치료 연구는 시간의 기능으로 평균 종양 부피에 묘사되고, 시간의 함수로서 초기 부피로 정상화된 종양 부피이다. 대조군에 비해 실험 집단의 반응에는 뚜렷한 차이가 있다.
표적화된 방사선 면역요법 전략의 단 하나 성분만을 수신하는 마우스에 있는 종양이 계속 증가하는 동안, 전체 사전 표적 방사선 면역 요법 요법 을 수신하는 마우스의 종양은 성장을 중단하고 궁극적으로 감소했습니다. 중요 한 것은, 어떤 독성 부작용 관찰 되었다, 그리고 모든 동물 내에서 무게를 유지 20% 그들의 초기 질량의. 놀랍게도, 실험 집단의 마우스는 조사의 끝에 생존의 완벽한 기록을 가지고 있었다.
이 절차를 시도할 때 종양을 정확하고 재현적으로 측정하는 것이 가장 중요합니다. 방사능으로 작업할 때 는 기관의 방사선 안전 책임자에게 문의하여 안전한 프로토콜과 시설을 개발하십시오. 적절한 안전 제어를 갖추면 노출이 제한되고 오염을 방지할 수 있습니다.
사전 타겟팅은 전통적인 방사선 면역 요법보다 배경 기관에 더 낮은 방사선 량을 부여합니다. 이 프로토콜을 공유함으로써 우리는 다른 사람들이 환자 치료를위한 새롭고 흥미로운 발전으로 이어질 자신의 모델과 아이디어를 테스트 할 수 있기를 바랍니다.
