פרוטוקול זה מתאר כיצד ליישם מתודולוגיה pretargeted על הקרנות ממוקדות של קסנוגרפים סרטן במודל העכבר. רדיוימונותרפיה או PRIT מפולחים מאפשרים לנו להזריק את הנוגדן ואת הרדיוליגנד בנפרד, ולתת לשניים לשלב ב-vivo באמצעות כימיית קליקים. בעוד אנו מציגים PRIT באמצעות מודל קסנוגרף של סרטן המעי הגס, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כל אנטיגן משטח מיקוד נוגדן.
חשוב לבחור אנטיגן שאינו מפנים במהירות או לשפוך בהרחבה כמו אלה יכולים להפחית את היעילות של הגישה. כדי לסנתז huA33-TCO הראשון להכין פתרון 125 microliter של 40 מיליגרם למיליליטר TCO-NHS ב מתילפורממיד יבש בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר. פתרון זה יכול להיות aliquoted וקפוא ב 80 מעלות צלזיוס לשימוש בניסויים עתידיים.
בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד 1.7 מיליליטר להכין פתרון חמישה מיליגרם למיליליטר של huA33 במיליליטר אחד של פוספט אגיר מלוחים. באמצעות aliquots קטן של 0.1 נתרן פחמתי טוחן, להתאים את ה- pH של פתרון הנוגדן בין 8.8 ו 9.0. השתמש בנייר pH או במד pH עם מיקרואלקטרוניקרוד כדי לפקח על ה- pH, ולתרגל טיפול שה- pH אינו עולה על 9.0.
הוסף נפח המתאים ל-40 שקילות טוחנות של TCO-NHS לפתרון הנוגדנים. כדי למנוע משקעים של TCO-NHS הידרופובי, להוסיף אותו לאט עם תסיסה. אפשר את התגובה דגירה ב 25 מעלות צלזיוס על מערבל תרמי במשך שעה אחת עם תסיסה קלה.
לפני טיהור ה- huA33-TCO immunoconjugate באמצעות עמודת התפלת אי-הכללה חד-פעמית ארוזה מראש, הצייד את עמודת אי-הכללת הגודל כמתואר על-ידי הספק כדי להסיר חומרים משמרים הקיימים בעמודה במהלך האחסון, אשר בדרך כלל כרוך בשטיפת העמודה חמש פעמים עם נפח של PBS התואם את נפח העמודה. מוסיפים את תערובת התגובה לעמודת אי-הכללת הגודל, ומוסיף את עוצמת הקול של תערובת התגובה. לאחר שתערובת התגובה נכנסה לעמודה, הוסף כמות מתאימה של PBS כדי להביא את הנפח הכולל של הפתרון שנוסף לעמודה עד 2.5 מיליליטר.
לאסוף את המוצר באמצעות שני מיליליטר של PBS כמו eluent. למדוד את הריכוז של huA33-TCO באמצעות UV מול ספקטרופוטומטר ניטור אורך הגל ב 280 ננומטר. אם פתרון עם ריכוז גבוה יותר של immunoconjugate הוא הרצוי לרכז את פתרון huA33-TCO באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלי עם 50, 000 ניתוק משקל מולקולרי בעקבות הוראות היצרן.
אחסן את ה- huA33-TCO החיסוני שהושלם ב- 4 מעלות צלזיוס בחושך. אם הוא ישמש יותר מארבעה ימים בעתיד לאחסן אותו ב 80 מעלות צלזיוס בחושך. בצינור צנטריפוגה 1.7 מיליליטר להוסיף 200 microliters של 0.25 מאגר אמוניום אצטט טוחנת מותאם pH 5.5.
הוסף את הכמות הרצויה של לותיום-177 כלוריד לפתרון המאגר. הסכום שנוסף יהיה תלוי במספר הנבדקים בניסוי, ובמנות הרדיואקטיביות המנוהלות. הוסף Tetrazine PEG7-DOTA ב- DMSO לתערובת הרדיואקטיבית.
הסכום שנוסף תלוי במספר הנבדקים. אפשר לפתרון דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. ודא שהלייבלינג הושלם באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה-רדיו-מיידית עם pH EDTA 5.5 מילימולארי 5.5 כשלב הנייד.
התווית Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine תישאר בבסיס בעוד חינם Lutetium-177 יהיה מתואם על ידי EDTA ולנסוע עם חזית ממס. זה קריטי כי המיקום של גידולים תת עוריים אינו מפריע לטכניקת האיפוק שלך. אני ממליץ לשים אותם בצד האגף כי הוא מול היד המרסנת שלך.
מאז שאני מרסן ביד שמאל בחרתי למקם את הגידולים באגף ימין. מיין עכברי עירום אתמיים נקבה עם קסנוגרף סרטן המעי הגס, כך נפח הגידול הממוצע בכל קבוצה שווה בערך. לשם כך, פרט את מספרי הזיהוי של בעלי חיים, תבנית חץ האוזן ונפח הגידול בשלוש עמודות נפרדות של תוכנית גיליון אלקטרוני.
מיין את הנתונים מנפח הגידול הקטן ביותר לנפח הגידול הגדול ביותר. בעמודה רביעית להקצות לכל בעל חיים מספר כלוב. תרכוב על אופניים בכלובים בתבנית דמוית נחש עד שכל החיות יוקצו לכלוב.
ברגע שהכלובים מוקצים למיין את הנתונים לפי מספר כלוב. כדי להזריק את המינונים לצייר immunoconjugate של 150 microliters של פתרון huA33-TCO במזרקים מטופלים מראש עם אלבומין סרום 1%bovine ב PBS, ולאחסן מזרקים אלה על קרח. כדי להזריק את radioligand, הראשון לצייר מינונים 150 microliters של 0.9%תמיסת מלח סטרילית המכילה 1.1 שקילות טוחנת של radiolabeled Tetrazine-PEG7-DOTA יחסית לכמות huA33-TCO מנוהל.
השתמש calipers כדי למדוד את הצד הארוך ביותר של הגידול מלבני, כמו גם את הרוחב אשר ניצב לאורך. לשקול כל עכבר על איזון כדי לעקוב אחר עלייה במשקל או ירידה במשקל לאורך זמן. לבסוף, לחשב את אמצעי האחסון באמצעות הנוסחה עבור נפח של אליפסואיד בהנחה כי הגובה שווה בערך לרוחב.
מוצג כאן הוא biodistribution של pretargeting in vivo עם huA33-TCO ו Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine בעכברים עירום אתמי הנושאים גידולים תת עוריים SW1222 קנים המעי התת עורי האנושי. כל מרווחי ההזרקה מייצרים ריכוזי פעילות גבוהים ברקמת הגידול, כמו גם ריכוזי פעילות נמוכים באיברים בריאים. מרווח ההזרקה של 24 שעות מאפשר את ספיגת הגידול הגבוהה ביותר בהזרקה של 120 שעות לאחר ההזרקה.
בהתבסס על ממצאים אלה נבחר מרווח זמן של 24 שעות למחקר הטיפול האורך הבא. מוצג כאן מחקר טיפול אורך של חמש קבוצות של עכברים הנושאים גידולים SW1222 תת עורית המתוארים בנפח הגידול הממוצע כפונקציה של זמן, ונפח הגידול מנורמל לנפח הראשוני כפונקציה של זמן. יש הבדל בולט בתגובת הקבוצות הניסיוניות בהשוואה לקבוצות הבקרה.
בעוד הגידולים בעכברים שקיבלו רק מרכיב אחד באסטרטגיית הרדיוימונותרפיה הטרום-מותכת המשיכו לגדול ללא בדיקה, הגידולים של העכברים שקיבלו את משטר הרדיוימונותרפיה המפותל המלא הפסיקו לגדול ובסופו של דבר התכווצו. חשוב לציין, לא נצפו תופעות לוואי רעילות, וכל בעלי החיים שמרו על משקל בטווח של 20% מהמאסה הראשונית שלהם. באופן מדהים, לעכברים של קבוצות הניסוי היה רקורד מושלם של הישרדות בסוף החקירה.
בעת ניסיון הליך זה יש חשיבות עליונה כדי למדוד במדויק ובשכפול את הגידולים. בעת עבודה עם רדיואקטיביות, התייעץ עם קצין בטיחות הקרינה של המוסד שלך כדי לפתח פרוטוקולים ומתקנים בטוחים. לאחר בקרת בטיחות נאותה במקום יגביל את החשיפה שלך ולהימנע זיהום.
Pretargeting מאפשר מינון קרינה נמוך יותר לאברי רקע מאשר רדיואימונופתרפיה מסורתית. על ידי שיתוף פרוטוקול זה אנו מקווים שאחרים יוכלו לבדוק את המודלים והרעיונות שלהם שיובילו להתקדמות חדשה ומרגשת לטיפול בחולה.
