Ce protocole décrit comment appliquer une méthodologie pré-ciblée à la radiothérapie ciblée des xénographes du cancer dans le modèle de souris. La radiothérapie pré-ciblée ou PRIT nous permet d’injecter l’anticorps et la radioligand séparément, et de laisser les deux combiner in vivo en utilisant la chimie de clic. Tandis que nous présentons PRIT utilisant un modèle xénographique du cancer côlorectal, cette technique peut être appliquée à n’importe quel antigène de surface ciblant l’anticorps.
Il est important de choisir un antigène qui ne s’internalise pas rapidement ou ne se perd pas abondamment car ceux-ci peuvent réduire l’efficacité de l’approche. Pour synthétiser huA33-TCO d’abord préparer une solution de 125 microlitres de 40 milligrammes par millilitre TCO-NHS dans le méthylformamide sec dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre. Cette solution peut être aliquoted et congelé à 80 degrés Celsius pour une utilisation dans de futures expériences.
Dans un tube distinct de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre préparer une solution de cinq milligrammes par millilitre de huA33 en un millilitre de phosphate tamponné salin. À l’aide de petits aliquots de carbonate de sodium molaire de 0,1 molaire, réglez le pH de la solution anticorps entre 8,8 et 9,0. Utilisez soit du papier pH, soit un compteur de pH avec une microélecrode pour surveiller le pH, et faites preuve de soin que le pH ne dépasse pas 9,0.
Ajoutez un volume correspondant à 40 équivalence molaire de TCO-NHS à la solution anticorps. Pour éviter les précipitations du TCO-NHS hydrophobe, ajoutez-le lentement et avec agitation. Laissez la réaction couver à 25 degrés Celsius sur un mélangeur thermique pendant une heure avec une légère agitation.
Avant de purifier l’immunoconjugate huA33-TCO à l’aide d’une colonne de désaltage d’exclusion de taille jetable préemballée, équilibrer la colonne d’exclusion de taille décrite par le fournisseur pour éliminer les agents de conservation présents dans la colonne pendant le stockage, ce qui implique habituellement de laver la colonne cinq fois avec un volume de PBS qui correspond au volume de la colonne. Ajouter le mélange de réaction à la colonne d’exclusion de taille, en notant le volume du mélange de réaction. Une fois que le mélange de réaction est entré dans la colonne ajouter une quantité appropriée de PBS pour apporter le volume total de solution ajoutée à la colonne jusqu’à 2,5 millilitres.
Recueillir le produit à l’aide de deux millilitres de PBS que l’élitente. Mesurer la concentration du huA33-TCO à l’aide d’un spectrophotomètre UV vis surveillant la longueur d’onde à 280 nanomètres. Si une solution avec une concentration plus élevée d’immunoconjugate est désirée, concentrez la solution huA33-TCO à l’aide d’une unité de filtre centrifuge avec un seuil de poids moléculaire de 50 000 selon les instructions du fabricant.
Conservez l’immunoconjugate huA33-TCO complété à 4 degrés Celsius dans l’obscurité. S’il doit être utilisé plus de quatre jours à l’avenir le stocker à 80 degrés Celsius dans l’obscurité. Dans un tube centrifugeuse de 1,7 millilitres ajouter 200 microlitres de 0,25 tampon d’acétate d’ammonium molaire ajusté au pH 5,5.
Ajouter la quantité désirée de chlorure lutérium-177 à la solution tampon. La quantité ajoutée dépendra du nombre de sujets dans l’expérience et des doses radioactives administrées. Ajouter tetrazine PEG7-DOTA dans DMSO au mélange radioactif.
Le montant ajouté dépend du nombre de sujets testés. Laissez la solution couver à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Vérifiez que la radioétique est complète à l’aide de la chromatographie radio-instantanée-mince couche avec 50 millimolar EDTA pH 5.5 que la phase mobile.
Le Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine étiqueté restera à la ligne de base tandis que le Lutetium-177 libre sera coordonné par l’EDTA et voyagera avec le front solvant. Il est essentiel que le placement des tumeurs sous-cutanées n’interfère pas avec votre technique de contention. Je recommande de les placer sur le flanc qui est opposé à votre main restrictive.
Depuis que je me retienne avec ma main gauche, j’ai choisi de placer les tumeurs sur le flanc droit. Trier les souris nues athymiques femelles atteintes d’un xénographe du cancer colorectal, de sorte que le volume moyen de tumeurs dans chaque cohorte soit à peu près égal. Pour ce faire, énumérez les numéros d’identification des animaux, le motif de l’encoche d’oreille et le volume tumoral dans trois colonnes distinctes d’un programme de feuille de calcul.
Trier les données du plus petit au plus grand volume tumoral. Dans une quatrième colonne, attribuez à chaque animal un numéro de cage. Pédalez à travers les cages dans un modèle de serpent jusqu’à ce que tous les animaux se voient attribuer une cage.
Une fois que les cages sont assignées trier les données par numéro de cage. Injecter les doses immunoconjuguées de 150 microlitres de solution huA33-TCO dans des seringues prétraitées avec de l’albumine de sérum 1% bovin dans PBS, et conserver ces seringues sur de la glace. Pour injecter le radioligand, prélouillez d’abord des doses dans 150 microlitres de saline stérile de 0,9 % contenant 1,1 équivalence molaire de la tetrazine-PEG7-DOTA radioétique par rapport à la quantité de huA33-TCO administrée.
Utilisez des étriers pour mesurer le côté le plus long de la tumeur oblongue ainsi que la largeur qui est perpendiculaire à la longueur. Pesez chaque souris sur un équilibre pour suivre le gain de poids ou la perte de poids au fil du temps. Enfin, calculer le volume en utilisant la formule pour le volume d’un ellipsoid en supposant que la hauteur est à peu près égale à la largeur.
Montré ici est la biodistribution d’un précibétrage in vivo avec huA33-TCO et Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine chez les souris nues athymiques portant des tumeurs sous-cutanées SW1222 caner colorectal humain. Tous les intervalles d’injection produisent des concentrations d’activité élevées dans le tissu tumoral ainsi que de faibles concentrations d’activité dans les organes sains. L’intervalle d’injection de 24 heures permet l’absorption tumorale la plus élevée à 120 heures après injection.
Basé sur ces résultats un intervalle de 24 heures a été choisi pour l’étude longitudinale suivante de thérapie. Montré ici est l’étude longitudinale de thérapie de cinq groupes de souris portant les tumeurs sous-cutanées de SW1222 dépeintes dans le volume moyen de tumeur en fonction du temps, et le volume de tumeur normalisé au volume initial en fonction du temps. Il y a une différence marquée dans la réponse des cohortes expérimentales par rapport aux groupes de contrôle.
Tandis que les tumeurs dans les souris recevant seulement un composant de la stratégie prétargeted de radioimmunotherapy ont continué à se développer sans contrôle, les tumeurs des souris recevant le régime complet de radioimmunothérapie prétargeted ont cessé de croître et ont finalement diminué. Fait important, aucun effet secondaire toxique n’a été observé, et tous les animaux ont maintenu un poids dans les 20% de leur masse initiale. Étonnamment, les souris des cohortes expérimentales avaient un dossier parfait de survie à la fin de l’enquête.
Lors de la tentative de cette procédure, il est de la plus haute importance de mesurer avec précision et reproductibilité les tumeurs. Lorsque vous travaillez avec la radioactivité, consultez l’agent de radioprotentgie de votre établissement pour élaborer des protocoles et des installations sécuritaires. La place de contrôles de sécurité appropriés limitera votre exposition et évitera la contamination.
Le préciblage permet une dose de rayonnement plus faible aux organes de fond que la radiothérapie traditionnelle. En partageant ce protocole, nous espérons que d’autres pourront tester leurs propres modèles et idées qui mèneront à de nouvelles avancées passionnantes pour le traitement des patients.
