Este trabajo es apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer 1R01CA154656, el NIAID 1R21AI092299, Instituto de Investigación del Cáncer, la Fundación San Baldrick, la Fundación Dana, la Fundación Ángel de Gabrielle, y Hyundai Motors de América &quot;La esperanza-on-Wheels&quot; del programa.

1. Ratón Titular de la Asamblea <ol><li> Superponer la cubierta de un plato 100-mm Petri de vidrio en la parte superior de una tapa 100-mm placa Petri de plástico hacia abajo. El vidrio debe estar tocando apenas el punto central de la placa de plástico. Para usar el vidrio como una plantilla, trace una marca en el plato de plástico. </li><li> Utilizar un taladro de mano (es decir, Dremel) para eliminar una porción de una tapa plato 100-mm de plástico para crear una plataforma forma de media luna. Esta tapa de plástico forma de media luna servirá como un apoyo para la parte superior del torso del ratón (Figura 1a). Haga dos agujeros en la tapa de la forma de media luna para conseguir la máscara de gas con una tira de alambre de metal. Fijar la tapa de plástico hasta el borde del plato de Petri de vidrio usando pegamento o un adhesivo equivalentemente fuerte (Figura 1b). </li><li> Pegue las tapas de los dos tubos de tapa abovedada-PCR (cortado en la bisagra) 1 cm de distancia del centro de la placa inferior con el fin de anclar solapas poplíteos piel. </li></ol> 2. Preparación del ratón <strong&gt; Nota: Con suficiente práctica, uno debe ser capaz de realizar la preparación del ratón y pasos de la cirugía en 20-30 minutos. <ol><li> Anestesie el ratón con isoflurano (2 a 2,5% para la inducción, 1,5 a 2% para la cirugía / imagen) mezclado en 1:1 S 2: mezcla de aire a un caudal de 1L/min utilizando un procedimiento IACUC aprobado. Una vez que el ratón está anestesiado, asegurar una máscara de gas sobre la nariz con cinta adhesiva. Determinar si el ratón es completamente anestesiado por la falta de respuesta a los pies y / o pellizcos de la cola. El nivel de isoflurano puede ajustarse en consecuencia para garantizar que el animal está completamente sedado, con una constante, no trabajó la frecuencia respiratoria entre 60-80 respiraciones por minuto. </li><li> Use una cortadora eléctrica para eliminar el vello en la pata derecha trasera y la zona inguinal del ratón. </li><li> Cepillar el pelo suelto y suavemente aplique una capa moderada de loción Nair a la zona afeitada con un hisopo de algodón. Después de un minuto de la solicitud inicial, quitar la Nair y limpiar la piel expuesta con un paño húmedouna toalla de papel. Asegúrese de que el mouse esté limpia y seca antes de continuar. </li><li> Haga una pequeña incisión de 2 a 3 mm con unas tijeras en la rodilla derecha para exponer el tendón extensor. </li><li> Aplicar Vetbond a lo largo del centro del soporte del ratón donde el cuerpo del ratón y de la pierna posicionado. Con cuidado, garantizar el ratón en el soporte, con la rodilla derecha hacia abajo, para exponer el hueco poplíteo derecho. Asegure el tendón de la rodilla derecha con Vetbond entre los 2 titulares de colgajo de piel para ayudar a estabilizar el campo de la imagen. </li><li> Estiramiento y la cinta de los brazos y la pierna izquierda a la plataforma superior del soporte. </li><li> Utilice una tira de alambre para asegurar la máscara de gas en su lugar. </li><li> Coloque el soporte bajo el microscopio de disección. La LN debe permanecer absolutamente inmóvil, con independencia del movimiento de la respiración del ratón. Por lo tanto, se deben tomar precauciones al realizar la cirugía para optimizar la estabilidad de la pierna. Determinar la posición de la cola (típicamente por encima de la cabeza) que contribuirá a la mayorla estabilidad a la pierna derecha y la cinta de la cola hacia abajo. </li></ol> 3. Cirugía <ol><li> Mientras que en el ámbito de disección, mantener la temperatura corporal del ratón usando un calentador o una almohadilla térmica. Para imágenes de éxito de la LN poplítea, es fundamental para mantener la temperatura corporal adecuada en toda la cirugía, así como para conservar la humedad del tejido mediante la constante aplicación de PBS caliente a los tejidos expuestos. </li><li> Esterilizar la piel con Betadine. Con unas tijeras estériles, hacer una incisión a través de la piel en la mitad de la pantorrilla derecha, y continúe cortando verticalmente hasta la parte superior del muslo derecho. </li><li> Hacer dos incisiones en la piel horizontales en la parte superior de la línea de incisión vertical para crear colgajos de piel a cada lado. </li><li> Retirar y la cola a ambos colgajos de piel con Vetbond. Al tirar de la piel tensa antes de aplicar Vetbond promoverá aún más la estabilidad de la pierna, sin embargo, asegúrese de que la tensión de la piel no ocluir el flujo sanguíneo (es decir, cambios en el vessel color o diámetro). Continuar pegamento abajo otras áreas de la piel para asegurar la estabilidad de la pierna antes de exponer la LN. El tamaño del ratón, se determinará la cantidad de piel extra que se necesita para pegar abajo. Por lo general, los ratones más grandes requerirán más piel que se pega al titular. </li><li> El LN deben encontrarse dentro de la fosa poplítea ni a la derecha oa la izquierda de la vena poplítea, dependiendo de la ubicación del ratón sobre el soporte. Retire con cuidado la LN a partir de tejidos adiposos y los músculos que rodean utilizando micro-disección pinzas y fórceps. Para minimizar el sangrado y el trauma, el uso de las técnicas sReproducción con micro-disección de pinzas para separar los tejidos. Descubra con cuidado el LN poplítea sin poner en peligro la integridad de los vasos sanguíneos aferentes y eferentes y los vasos linfáticos aferentes. </li><li> Para la estabilidad del tejido añadido, una cubierta de vidrio cuadrado puede ser colocado sobre la LN húmeda, apenas tocando la LN, evitando la oclusión del vaso. La cubierta de vidrio puede ser segured con el modelado de arcilla a ambos lados del ratón. </li><li> Los tintes fluorescentes vasos de diferentes tamaños (por ejemplo TRITC-dextrano, mínimo de 70kDa) puede ser introducido por vía intravenosa en este punto para ayudar a destacar la relación estructural y la integridad de la LN durante la exploración. </li></ol> 4. 2-Photon Imaging Acquisition ** <ol><li> Una vez que el LN está adecuadamente expuesta y la estabilidad se logra, sin demora transferir el conjunto de ratón titular todo sobre la platina del microscopio equipado con una almohadilla de temperatura retroalimentación programable calentamiento controlado en una cámara ambiental microscopio mantuvo a 37 ° C. Agregue bastante estéril tibia (37 ° C), PBS o HBSS para sumergir la LN. El volumen cambiará según el tamaño y la colocación del ratón. Alternativamente, PBS caliente o HBSS se puede aplicar directamente a la LN diseccionaron a través de una pipeta de vidrio fino provisto de una bomba peristáltica y pegada a la columna de la lente objetivo de inmersión. El flujo del líquido debe ser tal que unacolumna de agua estable puede mantenerse entre la lente y el tejido. </li><li> Mantener la temperatura PBS o HBSS a 37 ° C utilizando una almohadilla de calentamiento con una sonda de realimentación. Una sonda de temperatura separada debe ser colocado en el soporte de ratón para confirmar la temperatura de la PBS en el intervalo de 36,5 a 37,5 ° C. Una sonda rectal también puede ser utilizado para controlar la temperatura corporal central del ratón experimental durante todo el período de formación de imágenes. </li><li> Utilice una lámpara de epi-fluorescencia para ayudar a guiar la colocación de LN en el marco del objetivo. Adquirir las pilas fluorescentes de imágenes utilizando intervalos de tiempo que sean apropiados para la interacción celular deseada (normalmente 10 segundos a 1 minuto entre cada pila de imágenes xyz). </li><li> Controlar el estado del animal en la cámara de microscopio con frecuencia por inspección visual o mediante el uso de un sistema de vigilancia de los animales. Determinar si el ratón es completamente anestesiado por la falta de respuesta a los pies y / o pellizcos de las uñas, y una constante, no trabajó la frecuencia respiratoria entre 60-80 breaths por minuto. El nivel de isoflurano puede ajustarse en consecuencia para garantizar que el animal está completamente sedado. Con un control adecuado y la hidratación, los animales se pueden obtener imágenes durante 4-6 horas, o incluso antes. </li><li> Después del experimento de imágenes, la eutanasia al animal en una cámara de CO 2 con el protocolo aprobado por el IACUC la eutanasia. El animal no se debe permitir que emergen de la anestesia antes de la eutanasia. </li></ol> ** Este procedimiento quirúrgico puede ser también útil para otras formas de formación de imágenes intravital distinto 2P-LSM. 5. Los resultados representativos Varias células inmunes circulantes son reclutados a la LN a un ritmo diferente después de la transferencia adoptiva. Para CD4 + y CD8 +, estas células comienzan a llegar en la LN a través de los altos endoteliales vénula (HEV) minutos después de la transferencia IV con un número importante que llegan a la LN poplítea después de 2 a 4 horas 6,17-18. Para B celLS, un número sustancial se acumulan después de 8 a 24 horas 19. Los países en desarrollo activados debe comenzar a aparecer en los que drenan poplítea LN 8 a 16 horas después de la inyección pata 3,11,16-17. Figura 2a muestra que, incluso sin otras señales, tales como estructuras de los folículos de células B se puede discernir fácilmente por la acumulación de células redondas esférico visible bajo 2P-LSM 19. El uso de un reportero endógena fluorescente tal como los esplenocitos ubicuitina-GFP (Figura 2, vídeos complementarios 1 y 2), se puede realizar un seguimiento de estas migraciones de linfocitos y comportamientos para los días hasta una semana en condiciones no fisiológicas estimulantes. Con los detectores de múltiples canales de alta sensibilidad, es posible adquirir un conjunto de datos de imagen múltiple que abarca la información estructural, así como la dinámica de interacción entre múltiples socios celulares 17,19. Cuando las técnicas quirúrgicas se ejecutan correctamente y las condiciones ambientales cuidadosamente controlados, lymphocytes debe exhibir la velocidad de migración característica, como se muestra en la Figura 2c, 2d y en otros lugares 13-14,16. Los linfocitos también pueden presentar diferencias en la velocidad de la migración en función de las sub-regiones de la imagen LN sufriendo, puntos de referencia para adicionales, tales como los vasos sanguíneos (como se destaca en la introducción de colorantes de buques) ayudará a determinar la calidad de imagen en general (es decir, el control de la temperatura adecuada , un mínimo trauma a la LN, etc) 3,6,20. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> Figura 1. Construcción de un soporte para el ratón del ratón poplítea LN imagen a) Esquema de montaje del ratón titular;. B) Representante de preparación del ratón intravital, c) conjunto completo soporte de ratón, d) Cerrar los puntos de vista de la LN poplítea después de la exposición quirúrgica. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> Figura 2. Migración análisis de las buenas prácticas agrarias + linfocitosen la LN poplítea. (a) de instantáneas en 3D tomada de secuencia de imágenes 2P-LSM de la LN poplítea en un ratón receptor C57BL / 6 adoptively transferido a 1x10 7 GFP + linfocitos un día antes de la imagen. Línea de trazos indica la frontera de los folículos de células B, (b) temas de la migración de linfocitos durante 1 hora continua de imágenes; c) Distribución de la velocidad en general la migración de linfocitos. La velocidad media = 10,04 ± 4,26 m por minuto (un total de 15.125 pistas analizadas), d) distribución diferencial de la velocidad de migración celular de las células que se encuentran en el folículo de células B (barras abiertas, con una media de velocidad = 8,79 ± 3,90 m / min; total de 1.525 pistas analizadas ) y la zona de las células T (barras cerradas, con una media de velocidad = 13,77 ± 5,93 m / min, de un total de 1.250 pistas analizadas). Barras de escala = 50 micras. Suplementario de vídeo 1. Lapso de tiempo intravital 2P-LSM imagen de un ratón LN poplítea como se describe en la Figura 2. Un total de 1x10 7 linfocitos fueron aislados from una ubiquitina-GFP + ratón donante y adoptively transferido por vía intravenosa en el ratón receptor C57BL / 6 24 horas antes de la exploración. Una serie de XY (750 micras x 750 micras) imágenes de fluorescencia fueron tomadas a través de pilas z fijo (5 pasos m, 13 pasos) para producir una pila xyz de imágenes (750 micras x 750 micras x 65 micras), que se repite cada 20 segundos para un total de 60 minutos, dando como resultado una secuencia de imágenes para el análisis xyzt velocidad (Figuras 2c, 2d). Velocidad de reproducción = 450x. Barras de escala = 50 micras. Sello de tiempo = min: seg. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver el vídeo complementario</a> . Suplementario vídeo 2 Zoomed-en vista de la secuencia de imágenes en vídeo de consulta 1 en el folículo de las células B -. Células T frontera zona. Velocidad de reproducción = 450x. Barras de escala = 25 micras. El sello de hora = min: seg. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>lamen aquí para ver el vídeo complementario.

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	<li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node:+lessons+from+the+movies.">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+friends+in+out-of-the-way+places:+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging.">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).</li><li>Huang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+in+vivo+immunity:+insights+from+dynamic+in+situ+imaging+of+secondary+lymphoid+tissues.">Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+promotes+the+foreign+antigen+sensitivity+of+naive+T+lymphocytes.">Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes.</a> Nature. 420, 429-434 (2002).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+self-recognition+in+T+cell+responses+to+foreign+antigen.">On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen.</a> Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone.">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li><li>Celli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+dynamics+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+vivo.">Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo.</a> Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).</li><li>Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rulers+over+randomness:+stroma+cells+guide+lymphocyte+migration+in+lymph+nodes.">Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes.</a> Immunity. 25, 867-869 (2006).</li><li>Worbs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+stimulate+the+intranodal+motility+of+T+lymphocytes+in+vivo.">CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>von Andrian, U. H., Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+cellular+traffic+in+lymph+nodes.">Homing and cellular traffic in lymph nodes.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8++T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).</li><li>Castellino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li><li>Halin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrafollicular+activation+of+lymph+node+B+cells+by+antigen-bearing+dendritic+cells.">Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells.</a> Science. 312, 1672-1676 (2006).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+vision+for+dynamic+high-resolution+intravital+immune+imaging.">An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging.</a> Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los avances recientes en alta resolución de las técnicas de imagen in situ, especialmente 2P-LSM, se han acompañado de un creciente interés en el estudio del comportamiento dinámico celular in vivo. La técnica de imagen 4D en la LN poplíteo de un ratón vivo permite este tipo de análisis en el comportamiento dinámico de las células inmunes en el tejido ininterrumpido de micro-medio ambiente. El uso de 2P-LSM con detectores múltiples que abarcan todo el espectro visible permite imágenes simultáneas de recopilación de datos de poblaciones de células múltiples. Esto ahora puede lograrse mediante la utilización in vivo de células específicas de ratones reportero fluorescentes (por ejemplo ubiquitina-eGFP, PP, o ECFP-) combinados con el uso de la transferencia adoptiva de poblaciones de células marcadas diferencialmente utilizando colorantes orgánicos de células fluorescentes (por ejemplo CFSE , SNARF-1, y la célula Rastreador de Orange) para examinar los mecanismos celulares y la función dentro de la LN. Además de la observación directa de las interacciones entre diferencialmente rastreados clas poblaciones de ell, el conjunto de datos de imagen múltiple pueden someterse a un nuevo análisis con imágenes de los programas disponibles en el mercado de software de procesamiento (por ejemplo, Imaris, Bitplane Inc.) Para aclarar aún más el comportamiento y la función celular. Una amplia gama de posibilidades que existe para estudiar los mecanismos celulares de interacción que utilizan estos in vivo e in silico técnicas. La principal limitación del método experimental descrito aquí es la complejidad técnica inherente en el enfoque de la cirugía. Esta técnica requiere de un riguroso entrenamiento para familiarizarse con la anatomía pertinente y los procedimientos específicos y destrezas técnicas que requiere este protocolo. Para complicar aún más factores incluyen la dificultad para reducir al mínimo el daño tisular durante la exploración LN, la optimización de la estabilidad de los tejidos durante la exploración, y la prevención de lesiones térmicas y láser a la LN, antes y durante la experimentación de imágenes. Perturbación a cualquiera de estos factores dará lugar a menos que óptimo linfáticola motilidad ocyte y por lo tanto va a interferir con la correcta interpretación de los datos resultantes de imagen análisis.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurano, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nair - crema de depilación</td&gt;<td&gt; Nair</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS, 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Usar una almohadilla eléctrica</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Calefacción Pad Controller</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Aire y O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; La temperatura de la sonda</td&gt;<td&gt; Aparato de Harvard</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzas Dumont n º 5</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc.</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinza Graefe Iris, 7 cm curva</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc.</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tijeras</td&gt;<td&gt; Roboz quirúrgica Instrument Co., Inc.</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cubierta de plato 100x20 mm de vidrio de cultivo celular</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cubierta de plato 100x20 mm de poliestireno de cultivo celular</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; La solución de Betadine (10% povidona yodada Solución Tópica)</td&gt;<td&gt; Productos de Purdue, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

Los ganglios linfáticos (LNS) son los órganos linfoides secundarios, los cuales están estratégicamente ubicadas en todo el cuerpo para permitir la captura y presentación de antígenos extraños de los tejidos periféricos a la animación de la respuesta inmune adaptativa. Yuxtapuesta entre la respuesta inmune innata y adaptativa, la LN es un sitio ideal para estudiar las interacciones de las células inmunitarias 1,2. Los linfocitos (células T, células B y células NK), las células dendríticas (DC) y los macrófagos constituyen el grueso de la médula ósea derivados de los elementos celulares de la LN. Estas células se colocan estratégicamente en la LN que permita un control eficiente de los antígenos propios y el potencial de antígenos extraños 3-5. El proceso por el cual los linfocitos encuentran antígenos afines con éxito es un tema de intensa investigación en los últimos años, y consiste en una integración de los contactos moleculares, incluyendo receptores de antígenos, moléculas de adhesión, quimiocinas, y las estructuras del estroma, como la red de fibro-reticular 2,6-12 . </p&gt; Antes del desarrollo de la alta resolución en tiempo real fluorescente de imágenes in vivo, los investigadores se basaron en las imágenes estáticas, que sólo ofrece respuestas sobre la morfología, la posición y la arquitectura. Si bien estas preguntas son fundamentales en nuestra comprensión del comportamiento de las células inmunitarias, las limitaciones intrínsecas de esta técnica no permite un análisis para descifrar el tráfico de linfocitos y pistas ambientales que afectan el comportamiento celular dinámico. Recientemente, el desarrollo de intravital microscopía de dos fotones del láser de barrido (2P-LSM) ha permitido a los investigadores ver los movimientos dinámicos y las interacciones de las células individuales dentro de LN en directo in situ 12-16. En particular, y otros han aplicado esta técnica para el comportamiento de la imagen celular y las interacciones dentro de la poplítea LN, donde su naturaleza compacta, densa ofrece la ventaja de múltiplex de adquisición de datos sobre un área grande del tejido con diversos tejidos sub-estructuras 11,17-18 . Se is importante señalar que esta técnica ofrece beneficios adicionales más explantados técnicas de tejido de imágenes, que requieren la interrupción de la sangre, el flujo de la linfa, y en última instancia, la dinámica celular del sistema. Además, los tejidos explantados tener una ventana de tiempo muy limitado en el que el tejido permanece viable para las imágenes después del explante. Con una hidratación adecuada y el seguimiento de las condiciones ambientales de los animales, el tiempo de formación de imágenes puede ser ampliado considerablemente con esta técnica intravital. A continuación, presentamos un método detallado de la preparación del ratón LN poplítea con el fin de realizar imágenes intravital.

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Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Los recientes avances en microscopía de dos fotones han permitido en tiempo real<em&gt; En</em&gt; Imágenes in situ de los tejidos vivos en modelos animales, lo que mejora nuestra capacidad para investigar el comportamiento celular, tanto en condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, se exponen los trabajos preparatorios necesarios para realizar las imágenes intravital del nodo linfático poplíteo del ratón.

Imagen intravital del nodo linfático poplíteo ratón

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K vistas.  Case Western Reserve University. Los recientes avances en microscopía de dos fotones han permitido en tiempo real En Imágenes in situ de los tejidos vivos en modelos animales, lo que mejora nuestra capacidad para investigar el comportamiento celular, tanto en condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, se exponen los trabajos preparatorios necesarios para realizar las imágenes intravital del nodo linfático poplíteo del ratón.

Video: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Investigación

Inmunología e Infección

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo de imágenes de células T en los ganglios linfáticos murino Rebanadas con campo amplio y microscopios confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murino linfáticos superficiales Cirugía de los ganglios

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada<em&gt; Plasmodium</emLos esporozoitos&gt;

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...