El objetivo de este protocolo es cultivar microbiota intestinal in vitro. Permitirá el estudio de la dinámica de la microbiota sin tener que considerar la contribución de un componente moderno. Utilizando este sistema in vitro de varias etapas, contamos la comunidad de microbiotas para desarrollarse en la lumina y en la mucosa de múltiples regiones del colon se puede iniciar simultáneamente.
Una demostración visual de este método es útil debido a la complejidad de este sistema in vitro. Comience llenando el colon ascendente con 500 mililitros de medio definido, el colon transversal con 800 mililitros de medio definido, y el colon descendente con 600 mililitros de medio definido. Añadir a los agriportriers de mucina a las regiones del colon en una cantidad proporcional al volumen del reactor, y utilizar el tubo de muestra y la jeringa para eliminar cualquier medio definido en exceso de cada reactor.
Utilice las sondas de pH para ajustar el pH en cada reactor. Y encienda el nitrógeno en un lavado de 20 minutos. A continuación, descongele el homogeneato fecal de acuerdo con las directrices del fabricante antes de cargar una jeringa de 60 mililitros con la muestra de homogeneato fecal.
A continuación, inocular cada reactor de colon a través del puerto de la muestra con una cantidad de homogeneización igual al 5% de cada volumen del reactor para el cultivo nocturno con control de pH. A la mañana siguiente, limpie la cerradura luer en el puerto de muestra de cada biorreactor con alcohol. Cuando los puertos se hayan secado, conecte la jeringa de 30 mililitros, limpiada de todo el aire, a uno de los puertos de muestra.
Retire el émbolo de tres a cinco veces para asegurar una mezcla completa de los componentes del recipiente antes de aspirar 15 mililitros del supernato del cultivo del biorreactor. A continuación, transfiera la muestra luminal a un tubo Falcon estéril y colóquela sobre hielo. Para el análisis de ADN, recoja de uno a tres mililitros de líquido luminal utilizando una jeringa de cinco mililitros.
Recoger el supernate de los otros biorreactores de la misma manera. Para reservar material de muestra para el análisis de ácidos grasos de cadena corta, centrífugo 15 mililitros de la muestra luminal de interés, y jeringa filtra el supernate a través de un filtro de poro de 0,2 micrómetros para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Para reservar material de muestra para el análisis de ADN, centrifugar un mililitro de líquido luminal y almacene el pellet a menos 80 grados Centígrados.
Para la recolección de muestras de mucosas, retire los portadores de mucina preparados de un almacenamiento de cuatro grados centígrados y encienda el lavado de nitrógeno. Abra rápidamente la tapa del reactor y reemplace el 50% de los portadores de cada reactor por otros nuevos. Cuando todos los portadores hayan sido reemplazados, vuelva a sellar rápidamente la tapa y mantenga el nitrógeno al ras durante otros 20 minutos.
Luego alícuota 0.25 a 0.5 gramos de agar portador de mucina en tubos individuales de dos mililitros para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius hasta la extracción de ADN. Tres veces al día el sistema se aplica automáticamente. Esto comienza con 140 mililitros de medio definido transferidos al biorreactor estomacal seguido de una incubación de una hora con control de pH.
Al final de la incubación, el contenido del estómago se transfiere al intestino delgado junto con 60 mililitros de jugo pancreático. En el biorreactor del intestino delgado, el pH se ajusta automáticamente a 6,7 a 6,9, y el contenido se incuba durante 90 minutos. Durante esta incubación, el lavado de nitrógeno para cada sistema se enciende durante un total de 10 minutos.
Al final de esta incubación, el contenido del intestino delgado se transfiere al colon ascendente, desde el colon ascendente hasta el colon transversal, desde el colon transversal hasta el colon descendente y desde el colon descendente hasta los desechos. En este análisis representativo de coordenadas principales, la comunidad cambió depreciadamente entre los días uno y siete. Sin embargo, desde el día 11 después de la inoculación hasta el final del experimento, las muestras ocuparon una pequeña región del espacio de análisis de coordenadas principales para ambas muestras de puntuaciones de distancia basadas en la unidad taxonómica operativa, la presencia en ausencia y la abundancia.
La medición de tres aminoácidos prominentes de cadena corta revela que el ácido propiónico, el ácido butanoico y el ácido acético fluctúan desde el inicio del experimento hasta el día 15 después de la inoculación. Después del día 15, las cantidades de estos ácidos producidos en cada región del colon se mantuvieron constantes con sólo cambios mínimos hasta el final del experimento. El análisis de la comunidad estable para la fase luminal y mucosa de cada región del colon demuestra que las comunidades que se desarrollan en las regiones de colon individuales del sistema in vitro son similares a la composición del inóculo fecal.
La comparación de la diversidad alfa del sistema in vitro revela un nivel de diversidad similar al del inóculo para todas las regiones, excepto las muestras luminales de la región ascendente. Demostrar que el sistema de cultivo in vitro es capaz de producir una comunidad comparable al inóculo fecal tanto en términos de composición como de diversidad. Para producir una comunidad estable de microbiota intestinal utilizando este protocolo, es fundamental asegurarse de que las soluciones se preparan con precisión y que se mantengan las condiciones aneróbicas y los parámetros de pH durante todo el experimento.
Después de este procedimiento, las muestras se pueden analizar para la composición de la comunidad utilizando la secuenciación de ADN de próxima generación seguida de análisis bioinformático y para la funcionalidad mediante metabolómica.
