Das Ziel dieses Protokolls ist es, Darm-Mikrobiota in vitro zu kulturieren. Es wird die Untersuchung der Mikrobiota-Dynamik ermöglichen, ohne den Beitrag einer modernen Komponente berücksichtigen zu müssen. Mit diesem mehrstufigen In-vitro-System zählen wir die Mikrobiota-Gemeinschaft, die sich im Lumin entwickelt und auf der Schleimhaut von Multi-Regionen des Dickdarms gleichzeitig gestartet werden kann.
Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist aufgrund der Komplexität dieses In-vitro-Systems hilfreich. Beginnen Sie, indem Sie den aufsteigenden Doppelpunkt mit 500 Millilitern des definierten Mediums, den transversalen Doppelpunkt mit 800 Millilitern des definierten Mediums und den absteigenden Doppelpunkt mit 600 Millilitern des definierten Mediums füllen. Fügen Sie den Dickdarmregionen Mucin-Agrocarrier in einer Menge hinzu, die proportional zum Volumen des Reaktors ist, und verwenden Sie das Probenrohr und die Spritze, um überschüssiges definiertes Medium aus jedem Reaktor zu entfernen.
Verwenden Sie die pH-Sonden, um den pH-Wert in jedem Reaktor einzustellen. Und schalten Sie die Stickstoffspülung für 20 Minuten ein. Als nächstes tauen Sie das Fäkalhomogenat gemäß den Richtlinien des Herstellers auf, bevor Sie eine 60-Milliliter-Spritze mit der Fäkalhomogenatprobe beladen.
Impfen Sie dann jeden Dickdarmreaktor durch den Probenanschluss mit einer Homogenatmenge von 5 % jedes Reaktorvolumens für die Nachtkultur mit pH-Kontrolle. Am nächsten Morgen reinigen Sie die Luer-Sperre am Probenanschluss jedes Bioreaktors mit Alkohol. Wenn die Anschlüsse getrocknet sind, schließen Sie die 30-Milliliter-Spritze, die von aller Luft befreit ist, an einen der Probenanschlüsse an.
Ziehen Sie den Kolben drei- bis fünfmal ab, um eine gründliche Vermischung der Gefäßkomponenten zu gewährleisten, bevor Sie 15 Milliliter des Supernats der Kultur aus dem Bioreaktor ansaugen. Dann die Luminalprobe in ein steriles Falcon-Rohr geben und auf Eis legen. Für die DNA-Analyse sammeln Sie ein bis drei Milliliter Leuchtmittel mit einer Fünf-Milliliter-Spritze.
Sammeln Sie die Supernate aus den anderen Bioreaktoren auf die gleiche Weise. Um Probenmaterial für die kurzkettige Fettsäureanalyse beiseite zu legen, zentrieren Sie 15 Milliliter der luminalen Probe von Interesse und filtern Sie das Supernat durch einen 0,2 Mikrometer Porenfilter für minus 80 Grad Celsius Lagerung. Um Probenmaterial für die DNA-Analyse beiseite zu legen, zentrieren Sie einen Milliliter Leuchtflüssigkeit und lagern Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius.
Für die Schleimhautprobenernte die vorbereiteten Mucinträger aus der Vier-Grad-Celsius-Lagerung entfernen und die Stickstoffspülung einschalten. Öffnen Sie schnell den Reaktordeckel und ersetzen Sie 50 % der Träger in jedem Reaktor durch neue. Wenn alle Träger ausgetauscht wurden, verschließen Sie den Deckel schnell wieder und halten Sie den Stickstoffspülung für weitere 20 Minuten.
Dann aliquot 0,25 bis 0,5 Gramm Mucin Träger Agar in einzelne zwei Milliliter-Röhren für minus 80 Grad Celsius Lagerung bis zur DNA-Extraktion. Dreimal am Tag fährt das System automatisch. Dies beginnt mit 140 Millilitern definierten Mediums, das in den Magenbioreaktor übertragen wird, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit pH-Kontrolle.
Am Ende der Inkubation wird der Mageninhalt zusammen mit 60 MilliliterBauchsaft in den Dünndarm übertragen. Im Dünndarm-Bioreaktor wird der pH-Wert automatisch auf 6,7 bis 6,9 eingestellt und der Inhalt 90 Minuten lang inkubiert. Während dieser Inkubation wird der Stickstoffspülung für jedes System für insgesamt 10 Minuten eingeschaltet.
Am Ende dieser Inkubation werden die Inhalte aus dem Dünndarm in den aufsteigenden Dickdarm übertragen, vom aufsteigenden Dickpunkt zum transversalen Dickdarm, vom transversalen Dickdarm zum absteigenden Dickdarm und vom absteigenden Dickdarm zum Abfall. In dieser repräsentativen Hauptkoordinatenanalyse veränderte sich die Gemeinschaft zwischen den Tagen eins bis sieben abwertend. Vom 11. Tag nach der Impfung bis zum Ende des Experiments belegten die Proben jedoch einen kleinen Bereich des Hauptkoordinatenanalyseraums für beide Stichproben, um Entfernungsergebnisse basierend auf der operativen taxonomischen Einheit, Anwesenheit bis Abwesenheit und Häufigkeit zu beproben.
Die Messung von drei prominenten kurzkettigen Fettsäuren zeigt, dass Propionsäure, Butansäure und Essigsäure vom Beginn des Experiments bis zum 15. Tag nach der Impfung schwanken. Nach Tag 15 blieben die Mengen dieser Säuren, die in jeder Dickdarmregion produziert wurden, konstant und änderten sich bis zum Ende des Experiments nur minimal. Die Analyse der stabilen Gemeinschaft für die Korpus- und Schleimhautphase jeder Kolonregion zeigt, dass die Gemeinschaften, die sich in den einzelnen Kolonregionen des In-vitro-Systems entwickeln, der fäkalen Inokulumzusammensetzung ähneln.
Der Vergleich der Alpha-Diversität des In-vitro-Systems zeigt eine ähnliche Vielfalt wie das Inokulum für alle Regionen mit Ausnahme der luminalen Proben aus dem aufsteigenden Gebiet. Der Nachweis, dass das In-vitro-Kultursystem in der Lage ist, eine Gemeinschaft zu produzieren, die mit dem Fäkal-Inokulum sowohl in Bezug auf Zusammensetzung als auch Indiversität vergleichbar ist. Um eine stabile Darm-Mikrobiota-Gemeinschaft mit diesem Protokoll zu produzieren, ist es wichtig, sicherzustellen, dass Lösungen genau vorbereitet werden und dass anerobische Bedingungen und pH-Parameter während des gesamten Experiments beibehalten werden.
Nach diesem Verfahren können Proben auf Die Community-Zusammensetzung mit Hilfe der DNA-Sequenzierung der nächsten Generation analysiert werden, gefolgt von bioinformatischer Analyse und auf Funktionalität mit Metabolomik.
