이 프로토콜의 목표는 시험관내에서 장내 미생물을 배양하는 것입니다. 그것은 현대 성분의 기여를 고려하지 않고 미생물 역학의 연구를 허용합니다. 이 다단계 체외 시스템을 사용하여, 우리는 요광에서 개발하는 미생물 군사회를 계산하고 결장의 다중 영역의 점막에서 동시에 시작할 수 있습니다.
이 방법의 시각적 데모는 이 시험관 내 시스템의 복잡성으로 인해 유용합니다. 정의된 배지의 500 밀리리터, 정의된 매체의 800 밀리리터를 가진 횡단 결장, 그리고 정의된 매체의 600 밀리리터로 내림차순 결장으로 오름차순 결장작성을 통해 시작합니다. 머신 아그리캐리어를 반응기의 부피에 비례하는 양으로 결장 부위에 추가하고, 샘플 튜브및 주사기를 사용하여 각 반응기에서 초과 정의된 배지를 제거한다.
pH 프로브를 사용하여 각 반응기에서 pH를 조정합니다. 그리고 20 분 동안 질소 플러시를 켭니다. 다음으로, 대변 균질 샘플로 60 밀리리터 주사기를 적재하기 전에 제조업체의 지침에 따라 배설물 균질을 해동하십시오.
이어서, pH 제어를 통해 야간 배양에 대해 각 반응기 부피의 5%에 해당하는 양으로 샘플 포트를 통해 각 결장 반응기를 접종한다. 다음 날 아침, 각 생물 반응기의 샘플 포트에 루어 잠금 장치를 알코올로 청소하십시오. 포트가 건조되면 모든 공기의 지워진 30 밀리리터 주사기를 샘플 포트 중 하나에 연결합니다.
생물 반응기에서 문화의 초산기 15 밀리리터를 심기 전에 선박 구성 요소의 철저한 혼합을 보장하기 위해 플런저를 3 ~ 5 번 철회하십시오. 그런 다음 발광 샘플을 멸균 팔콘 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. DNA 분석을 위해, 5 밀리리터 주사기를 사용하여 발광액의 1~3밀리리터를 수집합니다.
동일한 방식으로 다른 생물 반응기 의 supernate 형태를 수집합니다. 짧은 사슬 지방산 분석을 위한 샘플 재료를 따로 설정하려면, 원심분리기 15 밀리리터의 관심 있는 요광 시료, 주사기는 영하 80도 저장을 위한 0.2 마이크로미터 모공 필터를 통해 초수를 필터링한다. DNA 분석을 위한 견본 물질을 따로 두려면, 원심분리기 발광액의 1밀리리터를 빼고 펠릿을 영하 80도에 저장합니다.
점막 시료 수확의 경우, 준비된 뮤신 운반체를 섭씨 4도에서 제거하고 질소 플러시를 켭니다. 원자로 뚜껑을 빠르게 열고 각 반응기의 캐리어의 50%를 새로운 원자로로 교체합니다. 모든 캐리어를 교체하면 뚜껑을 신속하게 다시 밀봉하고 질소 플러시를 20분 간 유지합니다.
그런 다음 DNA 추출까지 섭씨 80도 저장을 위해 개별 2 밀리리터 튜브로 0.25 ~ 0.5 그램의 뮤신 캐리어 천을 알리쿼트합니다. 시스템이 자동으로 순환하는 하루에 세 번. 이것은 pH 통제로 1 시간 배양에 선행된 위 생물 반응기로 옮겨진 정의된 매체의 140 밀리리터로 시작됩니다.
인큐베이션이 끝나면 위장의 내용물은 췌장 주스 60 밀리리터와 함께 소장으로 옮겨집니다. 소장 바이오 반응기에서 pH는 자동으로 6.7 에서 6.9로 조정되고 내용은 90 분 동안 배양됩니다. 이 잠복식 동안 각 시스템에 대한 질소 플러시가 총 10 분 동안 켜지습니다.
이 인큐베이션의 끝에서, 소장의 내용물들은 오름차순 결장에서 가로막결, 횡방향 결장에서 하강결에 이르기까지, 그리고 하강결에서 폐기물로 옮겨져 있다. 이 대표적인 수석 좌표 분석에서 커뮤니티는 1일과 7일 사이에 감가상각방식으로 변경되었습니다. 그러나, 11일째부터 실험이 끝날 때까지, 샘플은 운영 분류부, 부재 에 의한 존재 및 풍부도에 따라 샘플 거리 점수를 모두 샘플링하기 위해 주좌 분석 공간의 작은 영역을 점유하였다.
3개의 눈에 띄는 단사슬 지방산의 측정은 프로피오닉산, 부타노산 및 아세트산이 실험 시작부터 15일째까지 변동한다는 것을 보여줍니다. 15일 후, 각 결장 부위에서 생산되는 이 산의 양은 실험이 끝날 때까지 최소한의 변화만으로 일정하게 유지되었습니다. 각 결장 부위의 발광 및 점막 단계에 대한 안정적인 공동체의 분석은 체외 시스템의 개별 결장 영역에서 발생하는 지역 사회가 배설물 부쿠럼 조성과 유사하다는 것을 보여준다.
체외 계통의 알파 다이버시티를 비교하면 상승 영역으로부터의 발광 샘플을 제외한 모든 부위에 대한 무큐럼과 유사한 수준의 다양성을 나타낸다. 체외 문화 시스템은 구성과 다양성 면에서 배설물 무도에 필적하는 커뮤니티를 생성 할 수 있음을 입증합니다. 이 프로토콜을 사용하여 안정적인 장내 미생물군유전체를 생성하려면 솔루션이 정확하게 준비되고 실험 전반에 걸쳐 항예 조건 및 pH 매개 변수가 유지되도록 하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 샘플은 차세대 DNA 시퀀싱을 사용하여 커뮤니티 구성을 위해 분석될 수 있으며, 그 다음에는 생물정보 분석및 메타볼로믹스를 이용한 기능성을 분석할 수 있다.
