Le but de ce protocole est de culture du microbiote intestinal in vitro. Il permettra d’étudier la dynamique du microbiote sans avoir à tenir compte de la contribution d’un composant moderne. En utilisant ce système in vitro à plusieurs étapes, nous comptons la communauté du microbiote pour se développer dans le lumin et sur le muqueux de plusieurs régions du côlon peut être commencé simultanément.
Une démonstration visuelle de cette méthode est utile en raison de la complexité de ce système in vitro. Commencez par remplir le côlon ascendant avec 500 millilitres de milieu défini, le côlon transversaux avec 800 millilitres de milieu défini, et le côlon descendant avec 600 millilitres de milieu défini. Ajouter des agrocarriers mucine dans les régions du côlon dans une quantité proportionnelle au volume du réacteur, et utiliser le tube de l’échantillon et la seringue pour éliminer tout milieu défini excédentaire de chaque réacteur.
Utilisez les sondes de pH pour régler le pH dans chaque réacteur. Et allumez la chasse d’azote pendant 20 minutes. Ensuite, décongelez l’homogénéité fécale selon les directives du fabricant avant de charger une seringue de 60 millilitres avec l’échantillon homogénétisés fécal.
Ensuite, inoculer chaque réacteur du côlon à travers le port de l’échantillon avec une quantité d’homogénéité égale à 5% de chaque volume du réacteur pour la culture de nuit avec contrôle du pH. Le lendemain matin, nettoyez la serrure luer sur le port d’échantillonnage de chaque bioréacteur avec de l’alcool. Lorsque les ports ont séché, reliez la seringue de 30 millilitres, dégagée de tout air, à l’un des ports échantillonnés.
Retirez le piston trois à cinq fois pour assurer un mélange complet des composants du navire avant d’aspirer 15 millilitres du supernate de la culture du bioréacteur. Transférer ensuite l’échantillon luminal dans un tube falcon stérile et le placer sur la glace. Pour l’analyse de l’ADN, recueillir un à trois millilitres de liquide luminal à l’aide d’une seringue de cinq millilitres.
Recueillir la forme supernée des autres bioréacteurs de la même manière. Pour réserver le matériel d’échantillon pour l’analyse des acides gras à chaîne courte, centrifugeuse 15 millilitres de l’échantillon luminal d’intérêt, et filtrer la seringue le supernate à travers un filtre pore de 0,2 micromètre pour moins 80 degrés Celsius de stockage. Pour réserver des échantillons pour l’analyse de l’ADN, centrifugez un millilitre de liquide luminal et stockez la pastille à moins 80 degrés Celsius.
Pour la récolte d’échantillons muqueux, retirez les porteurs de mucine préparés de quatre degrés Celsius et allumez la chasse d’azote. Ouvrez rapidement le couvercle du réacteur et remplacez 50 % des porteurs de chaque réacteur par de nouveaux. Lorsque tous les transporteurs ont été remplacés, réédez rapidement le couvercle et maintenez la chasse d’azote pendant encore 20 minutes.
Puis aliquot 0,25 à 0,5 grammes d’agar porteur de mucine dans des tubes individuels de deux millilitres pour moins 80 degrés Celsius de stockage jusqu’à l’extraction de l’ADN. Trois fois par jour, le système fait automatiquement des cycles. Cela commence par 140 millilitres de milieu défini transféré dans le bioréacteur de l’estomac suivi d’une incubation d’une heure avec contrôle du pH.
À la fin de l’incubation, le contenu de l’estomac est transféré dans l’intestin grêle avec 60 millilitres de jus pancréatique. Dans le bioréacteur de l’intestin grêle, le pH est ajusté automatiquement à 6,7 à 6,9, et le contenu couve pendant 90 minutes. Pendant cette incubation, la chasse d’azote pour chaque système est activée pendant un total de 10 minutes.
À la fin de cette incubation, le contenu de l’intestin grêle est transféré dans le côlon ascendant, du côlon ascendant au côlon transversaux, du côlon transversaux au côlon descendant, et du côlon descendant aux déchets. Dans cette analyse représentative des coordonnées principales, la communauté a changé de façon amortie entre le premier et le septième jours. Toutefois, du jour 11 après l’inoculation jusqu’à la fin de l’expérience, les échantillons occupaient une petite région de l’espace d’analyse des coordonnées principales pour les deux échantillons afin d’échantillonner les scores de distance en fonction de l’unité taxonomique opérationnelle, de la présence à l’absence et de l’abondance.
La mesure de trois acides gras à chaîne courte proéminente révèle que l’acide propionique, l’acide butanoïque et l’acide acétique fluctuent du début de l’expérience jusqu’au jour 15 après l’inoculation. Après le jour 15, les quantités de ces acides produits dans chaque région du côlon sont restées constantes avec seulement des changements minimes jusqu’à la fin de l’expérience. L’analyse de la communauté stable pour la phase luminale et muqueuse de chaque région du côlon démontre que les communautés qui se développent dans les différentes régions du côlon du système in vitro sont similaires à la composition fécale de l’inoculum.
La comparaison de la diversité alpha du système in vitro révèle un niveau de diversité similaire à celui de l’inoculum pour toutes les régions à l’exception des échantillons luminaires de la région ascendante. Démontrer que le système de culture in vitro est capable de produire une communauté comparable à l’inoculum fécal tant en termes de composition que de diversité. Pour produire une communauté stable de microbiotes intestinaux en utilisant ce protocole, il est essentiel de s’assurer que les solutions sont préparées avec précision et que les conditions anérobies et les paramètres de pH sont maintenus tout au long de l’expérience.
À la suite de cette procédure, des échantillons peuvent être analysés pour la composition de la communauté à l’aide du séquençage de l’ADN de la prochaine génération, suivi d’une analyse bioinformatique et d’une fonctionnalité utilisant la métabolomique.
