O objetivo deste protocolo é cultivar microbiota intestinal in vitro. Permitirá o estudo da dinâmica da microbiota sem ter que considerar a contribuição de um componente moderno. Usando este sistema in vitro multi estágio, contamos que a comunidade de microbiotas para desenvolver no lumin e na mucosa de várias regiões do cólon pode ser iniciada simultaneamente.
Uma demonstração visual deste método é útil devido à complexidade deste sistema in vitro. Comece preenchendo o cólon ascendente com 500 mililitros de meio definido, o cólon transversal com 800 mililitros de meio definido, e o cólon descendente com 600 mililitros de meio definido. Adicione agricarriers de mucina às regiões do cólon em uma quantidade proporcional ao volume do reator, e use o tubo de amostra e a seringa para remover qualquer meio definido em excesso de cada reator.
Use as sondas de pH para ajustar o pH em cada reator. E ligue a descarga de nitrogênio por 20 minutos. Em seguida, descongele o homogeneato fecal de acordo com as diretrizes do fabricante antes de carregar uma seringa de 60 mililitros com a amostra homogênea fecal.
Em seguida, inocular cada reator de cólon através da porta de amostra com uma quantidade de homogeneizar igual a 5% de cada volume de reator para cultura noturna com controle de pH. Na manhã seguinte, limpe o bloqueio de luer na porta de amostra de cada bioreator com álcool. Quando as portas secarem, conecte a seringa de 30 mililitros, limpa de todo o ar, a uma das portas de amostra.
Retire o êmbolo três a cinco vezes para garantir uma mistura completa dos componentes do vaso antes de aspirar 15 mililitros do superatado da cultura do bioreator. Em seguida, transfira a amostra luminal para um tubo falcão estéril e coloque no gelo. Para análise de DNA, colete de um a três mililitros de fluido luminal usando uma seringa de cinco mililitros.
Colete a forma superata dos outros bioreatores da mesma forma. Para reservar material amostral para análise de ácidos graxos de cadeia curta, centrífugas 15 mililitros da amostra luminal de interesse, e filtro de seringa o superata através de um filtro de poros de 0,2 micrômetro para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para reservar material amostral para análise de DNA, centrífugas um mililitro de fluido luminal e armazenar a pelota a menos 80 graus Celsius.
Para a colheita da amostra de mucosa, remova os portadores de mucina preparados de quatro graus Celsius de armazenamento e ligue a descarga de nitrogênio. Abra rapidamente a tampa do reator e substitua 50% dos porta-aviões em cada reator por novos. Quando todos os porta-aviões tiverem sido substituídos, recira rapidamente a tampa e mantenha a descarga de nitrogênio por mais 20 minutos.
Em seguida, alíquota de 0,25 a 0,5 gramas de ágar portador de mucina em dois tubos mililitros individuais para armazenamento de menos 80 graus Celsius até a extração de DNA. Três vezes ao dia o sistema pedala automaticamente. Isso começa com 140 mililitros de meio definido transferidos para o bioreator estomacal seguido de uma incubação de uma hora com controle de pH.
No final da incubação, o conteúdo do estômago é transferido para o intestino delgado junto com 60 mililitros de suco pancreático. No bioreator do intestino delgado, o pH é ajustado automaticamente para 6,7 a 6,9, e o conteúdo incuba por 90 minutos. Durante esta incubação, a descarga de nitrogênio para cada sistema é ligada por um total de 10 minutos.
No final desta incubação, os conteúdos do intestino delgado são transferidos para o cólon ascendente, do cólon ascendente ao cólon transversal, do cólon transverso ao cólon descendente, e do cólon descendente para o lixo. Nesta análise representativa das coordenadas principais, a comunidade mudou depreciadamente entre os dias um e sete. No entanto, desde o 11º pós-inoculação até o final do experimento, as amostras ocuparam uma pequena região do espaço principal de análise de coordenadas para ambos os escores de distância amostrais com base na unidade taxonômica operacional, presença à ausência e abundância.
A medição de três proeminentes ácidos graxos de cadeia curta revela que o ácido propiônico, o ácido butanoico e o ácido acético flutuam desde o início do experimento até o dia 15 pós-inoculação. Após o dia 15, as quantidades desses ácidos produzidos em cada região do cólon permaneceram constantes com apenas mudanças mínimas até o final do experimento. A análise da comunidade estável para a fase luminal e mucosa de cada região do cólon demonstra que as comunidades que se desenvolvem nas regiões coloniais individuais do sistema in vitro são semelhantes à composição do inóculo fecal.
A comparação da diversidade alfa do sistema in vitro revela um nível de diversidade semelhante ao do inóculo para todas as regiões, exceto as amostras luminais da região ascendente. Demonstrando que o sistema de cultura in vitro é capaz de produzir uma comunidade comparável ao inóculo fecal, tanto em termos de composição quanto de diversidade. Para produzir uma comunidade de microbiota intestinal estável usando este protocolo, é fundamental garantir que as soluções sejam preparadas com precisão e que as condições aneróbicas e parâmetros de pH sejam mantidos durante todo o experimento.
Após este procedimento, as amostras podem ser analisadas para composição comunitária usando sequenciamento de DNA de próxima geração seguido de análise bioinformática e para funcionalidade utilizando metabolômica.
