このプロトコルの目標は、腸内微生物叢を培養することです。これは、現代のコンポーネントの貢献を考慮することなく、微生物叢のダイナミクスの研究を可能にします.この多段階インビトロシステムを用いて、我々は、発光と結腸の多領域の粘膜に発達する微生物叢のコミュニティを同時に開始することができる数える。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、このin vitroシステムの複雑さのために有用である。500ミリリットルの定義された培地、800ミリリットルの定義された媒体を持つ横断コロン、および定義された培地の600ミリリットルの降順コロンで昇順コロンを充填することから始めます。ムチンアグリキャリアを、反応器の体積に比例した量でコロン領域に加え、サンプルチューブとシリンジを使用して各反応器から定義された余分な培地を除去する。
pHプローブを使用して各反応器のpHを調整します。そして、窒素のフラッシュを20分間オンにします。次に、60ミリリットルのシリンジを便ホモジネートサンプルでロードする前に、製造業者のガイドラインに従って便のホモゲネートを解凍する。
次いで、pH制御を伴う一晩培養のための各反応器容積の5%に等しいホモゲネートの量でサンプルポートを通して各大腸反応器を接種する。翌朝、各バイオリアクターのサンプルポートのルアーロックをアルコールで清掃します。ポートが乾燥したら、30ミリリットルのシリンジを、すべての空気を取り除いたサンプルポートの1つに接続します。
プランジャーを3~5回引き出して、バイオリアクターから培養物の上華を15ミリリットル吸引する前に、容器成分の完全な混合を確実にします。その後、ルミナルサンプルを無菌ファルコンチューブに移し、氷の上に置きます。DNA分析のために、5ミリリットルのシリンジを使用して1〜3ミリリットルの発光流体を収集します。
スーパーネイトは、同様に他のバイオリアクターを収集します。短鎖脂肪酸分析用のサンプル材料を確保するために、遠心分離機15ミリリットルの目的の発光サンプル、および0.2マイクロメートルの孔フィルターを通して上方をフィルターしてマイナス80°Cの貯蔵を行います。DNA分析用のサンプル材料を確保するために、1ミリリットルの発光流体を遠心分離し、ペレットをマイナス80°Cで保存します。
粘膜サンプルの収穫のために、4°Cの貯蔵から準備されたムチンのキャリアを取り除き、窒素のフラッシュをオンにします。原子炉の蓋を素早く開き、各反応器のキャリアの50%を新しいものに置き換えます。すべてのキャリアが交換されたら、蓋を素早く再密封し、窒素をさらに20分間保持します。
次に、アリコート0.25〜0.5グラムのムチンキャリア寒天をDNA抽出までマイナス80度摂氏貯蔵用の個々の2ミリリットルチューブに入れる。1日3回、システムは自動的にサイクルします。これは、胃バイオリアクターに移された定義された培地の140ミリリットルから始まり、続いてpH制御による1時間のインキュベーションが続く。
インキュベーションの終わりに、胃の内容物は膵液の60ミリリットルと一緒に小腸に移される。小腸バイオリアクターでは、pHは6.7〜6.9に自動的に調整され、内容物は90分間インキュベートされる。このインキュベーションの間、各システムの窒素フラッシュは合計10分間オンになります。
このインキュベーションの終わりに、小腸からの内容物は、上昇結腸、昇順結腸から横コロン、横断大腸から下降結腸、および下降結腸から廃棄物に移される。この代表的な主座標分析では、コミュニティは1日目から7日目の間に不安定に変化しました。しかし、接種後11日目から実験終了まで、サンプルは、操作的な分類単位に基づいて距離スコアをサンプリングするサンプルの主要な座標分析空間の小さな領域を占め、存在不在、および豊富さ。
3つの顕著な短鎖脂肪酸の測定は、プロピオン酸、ブタイン酸、および酢酸が実験の開始から15日目の接種まで変動することを明らかにします。15日目以降、各大腸領域で産生されるこれらの酸の量は、実験の終わりまで最小限の変化で一定のままでした。各大腸領域の発光および粘膜相の安定したコミュニティの分析は、インビトロ系の個々の結腸領域で発達するコミュニティが、便内接種組成物と類似していることを示している。
in vitroシステムのアルファ多様性の比較は、上昇領域からの発光サンプルを除くすべての領域の接種物と同様のレベルの多様性を明らかにする。インビトロ培養システムが、構成と多様性の両面で便の接種に匹敵する共同体を生み出すことができることを実証する。このプロトコルを使用して安定した腸内微生物叢コミュニティを作り出すためには、溶液が正確に調製され、実験全体を通して無神経な状態とpHパラメータが維持されるようにすることが重要です。
この手順に従って、サンプルは、次世代DNAシーケンシングを使用したコミュニティ組成、その後のバイオインフォマティクス解析、およびメタボロミクスを用いた機能性について分析することができます。
