L'obiettivo di questo protocollo è quello di coltura del microbiota intestinale in vitro. Consentirà lo studio della dinamica microbiota senza dover considerare il contributo di una componente moderna. Utilizzando questo sistema in vitro multistazione, contiamo che la comunità microbiota si sviluppi nel lumin e sulla mucosa di più regioni del colon può essere avviata contemporaneamente.
Una dimostrazione visiva di questo metodo è utile a causa della complessità di questo sistema in vitro. Inizia riempiendo i due punti ascendenti con 500 millilitri di mezzo definito, il colon trasversale con 800 millilitri di mezzo definito e il colon decrescente con 600 millilitri di mezzo definito. Aggiungere gli agricarrier mucina alle regioni del colon in una quantità proporzionale al volume del reattore e utilizzare il tubo campione e la siringa per rimuovere qualsiasi mezzo definito in eccesso da ciascun reattore.
Utilizzare le sonde di pH per regolare il pH in ogni reattore. E accendere il filo di azoto per 20 minuti. Successivamente, scongelare l'omogeneato fecale secondo le linee guida del produttore prima di caricare una siringa da 60 millilitri con il campione di omogenato fecale.
Quindi, inoculare ogni reattore colon attraverso la porta del campione con una quantità di omogeneato pari al 5% di ogni volume del reattore per la coltura notturna con controllo del pH. La mattina dopo, pulire la serratura luer sulla porta del campione di ogni bioreattore con alcol. Quando le porte si sono asciugate, collegare la siringa da 30 millilitri, sgombrata da tutta l'aria, a una delle porte del campione.
Ritirare lo stantuffo da tre a cinque volte per garantire un'accurata miscelazione dei componenti del recipiente prima di aspirare 15 millilitri del supernato della coltura dal bioreattore. Quindi trasferire il campione luminale in un tubo Falcon sterile e posizionare sul ghiaccio. Per l'analisi del DNA, raccogliere da uno a tre millilitri di liquido luminare usando una siringa da cinque millilitri.
Raccogliere il supernato formare gli altri bioreattori allo stesso modo. Per mettere da parte il materiale campione per l'analisi degli acidi grassi a catena corta, centrifugare 15 millilitri del campione luminare di interesse e filtrare il supernato attraverso un filtro dei pori da 0,2 micrometri per una conservazione di meno 80 gradi Celsius. Per mettere da parte il materiale campione per l'analisi del DNA, centrifugare un millilitro di liquido luminare e conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius.
Per la raccolta del campione di mucosa, rimuovere i portatori di mucina preparati dallo stoccaggio di quattro gradi Celsius e accendere il filo di azoto. Aprire rapidamente il coperchio del reattore e sostituire il 50% dei supporti di ciascun reattore con nuovi. Quando tutti i supporti sono stati sostituiti, risigillare rapidamente il coperchio e mantenere il filo di azoto per altri 20 minuti.
Quindi aliquota da 0,25 a 0,5 grammi di agar trasportatore di mucina in singoli due tubi millilitro per meno 80 gradi Celsius di stoccaggio fino all'estrazione del DNA. Tre volte al giorno il sistema cicli automaticamente. Questo inizia con 140 millilitri di mezzo definito trasferiti nel bioreattore dello stomaco seguito da un'incubazione di un'ora con controllo del pH.
Alla fine dell'incubazione, il contenuto dello stomaco viene trasferito nell'intestino tenue insieme a 60 millilitri di succo pancreatico. Nel bioreattore dell'intestino tenue, il pH viene regolato automaticamente a 6,7 a 6,9 e il contenuto incuba per 90 minuti. Durante questa incubazione, il scarico dell'azoto per ogni sistema viene acceso per un totale di 10 minuti.
Alla fine di questa incubazione, il contenuto dell'intestino tenue viene trasferito nel colon ascendente, dal colon ascendente al colon trasversale, dal colon trasversale al colon discendente e dal colon discendente ai rifiuti. In questa analisi delle coordinate principali rappresentative, la comunità è cambiata deprecabilmente tra i giorni uno e sette. Tuttavia, dal giorno 11 dopo l'inoculazione fino alla fine dell'esperimento, i campioni occupavano una piccola regione dello spazio di analisi delle coordinate principali per entrambi i punteggi di distanza del campione in base all'unità tassonomica operativa, alla presenza all'assenza e all'abbondanza.
La misurazione di tre importanti acidi grassi a catena corta rivela che l'acido propionico, l'acido butanoico e l'acido acetico fluttuano dall'inizio dell'esperimento fino al giorno 15 dopo l'inoculazione. Dopo il giorno 15, le quantità di questi acidi prodotte in ogni regione del colon rimasero costanti con solo cambiamenti minimi fino alla fine dell'esperimento. L'analisi della comunità stabile per la fase luminale e mucosa di ogni regione del colon dimostra che le comunità che si sviluppano nelle singole regioni del colon del sistema in vitro sono simili alla composizione dell'inoculo fecale.
Il confronto della diversità alfa del sistema in vitro rivela un livello di diversità simile a quello dell'inoculo per tutte le regioni ad eccezione dei campioni luminali della regione ascendente. Dimostrando che il sistema di coltura in vitro è in grado di produrre una comunità paragonabile all'inoculo fecale sia in termini di composizione che di diversità. Per produrre una comunità di microbiota intestinali stabile utilizzando questo protocollo, è fondamentale garantire che le soluzioni siano preparate con precisione e che le condizioni anerobiche e i parametri di pH siano mantenuti durante l'esperimento.
Seguendo questa procedura, i campioni possono essere analizzati per la composizione della comunità utilizzando il sequenziamento del DNA di nuova generazione seguito dall'analisi bioinformatica e per la funzionalità utilizzando la metabolomica.
