Estudios de probióticos, en ratones neonatales usando gavage. Introducción, este protocolo de vídeo detallará la configuración y el procedimiento para gavaging probióticos a un ratón neonatal, en su día de vida dos. La colección estéril de intestinos, para el análisis del microbioma intestinal, también se detalla en este protocolo.
Algunos resultados representativos, también se incluyen en este protocolo, para introducir algunos de los tipos de datos, que se pueden derivar de seguir este procedimiento. Gavage intraesófago de ratón neonatal, día de la vida dos. Coloque la jaula de la presa en la misma capucha donde se colocan las jaulas experimentales en la almohadilla de calentamiento, la almohadilla de calentamiento se establece en el nivel medio, que es de aproximadamente 38 grados celsius.
Retire un poco de tierra anidando de la jaula de casa, frote la anidación con las manos enguguas para transferir los aromas, del material de anidación en el guante. Esto reduce la transferencia de aromas extraños.al cachorro cuando se manipula. Esto a su vez reduce el riesgo, de abandono o canibalización, por la presa debido a olores extraños.
Cuando los cachorros son devueltos a la jaula de casa, después del procedimiento. Cree un nido de retención en forma cónica y colóquelo en la nueva y estéril jaula experimental, que ha sido precalentada. Transfiera a todos los cachorros de la jaula de casa.a la jaula experimental.
Mueve a los cachorros a la anidación cónica.en la jaula experimental. Retire la jaula de la presa y colóquela lejos de la zona de gavaging. Esto reduce las condiciones estresantes para la presa, al impedir que la presa escuche al cachorro, haciendo el procedimiento.
Abra el envase de la jeringa para facilitar el acceso. Retire la aguja de alimentación auto clave gavage, de una manera estéril, y adjúntela a la cabeza de la jeringa. La aguja se lava con 70% de etanol, y agua, antes de autoclave.
Diferentes conjuntos de agujas de alimentación, se utilizan entre los grupos de tratamiento y control, para evitar la contaminación cruzada. Elaborar la solución de colorante probiótico en la jeringa, invertir y mover con el dedo para eliminar las burbujas, y el espacio vacío en el volumen dentro de la jeringa. Retroceda el émbolo para limpiar el líquido, del espacio muerto de las agujas, y luego presione el émbolo, para expulsar el aire y las burbujas de aire, esto es importante para asegurarse.de que no se gavaged burbujas de aire.en el animal.
Ajuste el volumen deseado en la jeringa, para un día de vida dos ratón, no se deben gavagd más de 30 microlitros. La marca negra que se ve en la aguja, indica la longitud máxima, que la aguja se puede insertar en el ratón. Esta longitud se obtiene mediante la medición externa, la longitud entre el hocico y el proceso de xifoide.
Coloque la jeringa sobre una superficie estéril, retire el cachorro que se va a gavaged de la jaula experimental y observe si hay signos de salud. Estos signos de salud incluyen, respiración regular y coloración rosa de la piel. Coloque el cachorro en la hoja de observante estéril, en la almohadilla de calentamiento.
Lubricar la superficie externa de la aguja de alimentación, utilizando el disolvente utilizado para disolver el probiótico. Aquí es agua dextrosa, esto informa la entrada suave de la aguja, en el esófago del animal. Escoja el cachorro por la piel del cuello, usando el pulgar y el dedo índice.
Sujete la jeringa en su mano dominante, en una posición que le permita insertar la aguja, y presione el émbolo sin ajustar los dedos. Inserte el bulbo de la aguja de alimentación en un ángulo de 45 grados, hasta que llegue a la parte posterior de la boca. Gire la mano con la aguja lejos de usted, mientras sostiene la bombilla de la aguja en su lugar, una vez que la aguja está lisa con el torso, comenzará a deslizarse.
Asegúrese de que no se aplica presión adicional a la jeringa para estimular el movimiento. El proceso de tragar será lento, y la paciencia es la clave. A medida que el cachorro envejece, la deglución de la aguja, será más rápida y fácil.
La aguja de alimentación ha sido pre marcada, para evitar que el bulbo entre en el estómago. Una vez que el marcado se acerca al hocico, detener el movimiento de la aguja, y entregar lentamente la solución probiótica. Una vez completada la entrega, retire la aguja lentamente.
Coloque el ratón en la almohadilla de calentamiento y observe la recuperación. Un reflejo jadeante se resuelve y la frecuencia cardíaca aumenta, una coloración rosa saludable reaparece, y reflejo de jadeo sin resolver después de 45 segundos, indica un gavage fallido y el ratón debe ser eutanizado. El tinte de gavage debe ser visible a través de la piel pálida, el tinte debe ser sólo visible en el área, donde se encuentra generalmente la mancha de la leche.
El confinamiento al tinte al estómago.indica un gavage exitoso. Si el tinte se encuentra en la cavidad torácica, o en cualquier otra cavidad que no sea el estómago, el ratón debe ser eutanizado, ya que indica un gavage fallido. Se necesita una presión mínima.para desquiñe un día de vida dos ratóns.
Los signos de desenfarse a duro pueden incluir, incapacidad para respirar, jadeo significativo, y sacar la lengua durante una larga duración. Algunas sugerencias para el procedimiento de gavaging, descansar la parte posterior de su dedo de las manos desaliñadas, en la palma de la mano que sostiene la jeringa, esto asegura que la posición de los cachorros es estable, durante el procedimiento y la aguja, no se mueve alrededor dentro del animal. Durante el gavage, el peso de la aguja, facilitará el deslizamiento, permitirá que la aguja sea tragada por el cachorro, sin ejercer ninguna presión externa.
Devuelva a los cachorros a la jaula de la presa, y siga con el monitoreo según su horario. Colección de muestras intestinales para el análisis de colonización. El animal fue humanamente eutanasiado, por métodos aprobados en el Protocolo de Cuidado y Uso Animal.
La mesa quirúrgica está forrada con una estera absorbente estéril. Las herramientas han sido esterilizadas usando 70 porcentajes de etanol, y una esterilización de ritmo caliente a 250 grados Celsius. El servicio externo del animal, se desinfecta con 70 porcentajes de etanol.
Cortar la piel externa usando fórceps y tijeras, en cuatro cuadrantes, mientras se toma especial precaución, para no lacerar el peritoneo. Mete la piel hacia un lado de tal manera que el peritoneo esté bien expuesto. Utilice diferentes herramientas estériles nuevas, para cortar el peritoneo abierto, y tenga especial cuidado de no lacerar, los órganos internos en este proceso.
Localice el estómago del cachorro y sujete el duodeno. Usando dos fórceps estériles, localice el estómago y localice el extremo duodenal del estómago. Abrazadera justo en la intersección, del estómago y el duodeno.
Usa dos nuevos fórceps estériles para ejecutar los intestinos, usa un forcep para sostener el duodeno, mientras usas el otro para arrancar cualquier tejido conectivo, manteniendo los intestinos intactos. A medida que desentraña, coloque los intestinos.en la almohadilla absorbente estéril que cubre al animal. Si se rompen los intestinos, durante el procedimiento de desentrañamiento, marque el área en la que se rasgó, de modo que la orientación del intestino esté intacta.
Sujete el extremo rectal y haga cortes en ambas abrazaderas. Coloque el intestino intacto, sobre una lámina de aluminio marcada estéril en la orientación correcta. Marque cualquier sección del intestino, necesaria para su análisis posterior.
ADN se extrae de estos intestinos, utilizando un procedimiento de extracción optimizado, y el análisis QPCR se hace para cuantificar el probiótico. El ADN se extrae de los intestinos frescos, o los intestinos se pueden almacenar, a 80 grados Celsius negativos utilizando una caja de congelador. Resultados representativos, lactobacillus plantarium, colonización con gavage todos los días y cada dos días.
Se observó una señal de LP más alta en los intestinos de los ratones, gavaged cada dos días, en comparación con los ratones gavaged todos los días. Por lo tanto, se construyeron experimentos posteriores, utilizando gavages cada dos días. Lactobacillus plantarum gavaged ratones, co-alojado con ratones sin gavaged.
Se observaron señales variables de LP en ratones no tratados, que fueron co-alojados con ratones gavaged LP. La propagación de la colonización de LP, es posible con las familias de basura, y por lo tanto las condiciones de tratamiento, fueron separados por jaulas para nuestros experimentos posteriores. Conclusión, este procedimiento se puede utilizar para entregar cantidades precisas de cualquier líquido a ratones recién nacidos.
El muestreo de intestinos se puede extrapolar, para explorar los cambios en el microbioma, a través de otros métodos de análisis. El alcance de este video es proporcionar una plataforma, para que los investigadores utilicen modelos de gavage de ratón neonatal, para entender los mecanismos detrás de los efectos observados, con la administración temprana de probióticos. Un agradecimiento especial al equipo de Laboratorio Kollmann, The Animal Care Services de la Universidad de La Colombia Británica, por hacer posible este estudio.
