Studi probiotici, nei topi neonatale usando il gavage. Introduzione, questo protocollo video descriverà in dettaglio la configurazione e la procedura per il gavaging probiotici a un mouse neonatale, nel giorno della seconda vita. Anche la raccolta sterile dell'intestino, per l'analisi del microbioma intestinale, è dettagliata in questo protocollo.
Alcuni risultati rappresentativi, sono inclusi anche in questo protocollo, per introdurre alcuni dei tipi di dati, che possono derivare dal seguire questa procedura. Gavage intra-esofageo del topo neonatale, giorno della vita due. Posizionare la gabbia della diga nella stessa cappa in cui le gabbie sperimentali sono posizionate sul riscaldante, la pastiglia riscaldante è impostata a livello medio, che è di circa 38 gradi Celsius.
Rimuovere un po 'di nidificazione del terreno dalla gabbia di casa, strofinare la nidificazione con le mani guantate per trasferire i profumi del materiale di nidificazione sul guanto. Ciò riduce il trasferimento di profumi estranei, sul cucciolo quando viene maneggiato. Questo a sua volta riduce il rischio, di abbandono o cannibalizzazione, da parte della diga a causa di profumi estranei.
Quando i cuccioli vengono restituiti alla gabbia di casa, dopo la procedura. Crea un nido di tenuta a forma conica e mettilo nella nuova e sterile gabbia sperimentale, che è stata pre-riscaldata. Trasferisci tutti i cuccioli dalla gabbia di casa, nella gabbia sperimentale.
Spostare i cuccioli nella nidificazione conica, nella gabbia sperimentale. Rimuovere la gabbia della diga e posizionarla, lontano dall'area di gavaging. Ciò riduce le condizioni stressanti per la diga, impedendo alla diga di sentire il cucciolo, eseguendo la procedura.
Aprire la confezione della siringa per un facile accesso. Rimuovere l'ago di alimentazione automatica del gavage clave, in modo sterile, e attaccarlo alla testa della siringa. L'ago viene lavato con il 70% di etanolo e acqua, prima dell'autoclave.
Diversi set di aghi di alimentazione, vengono utilizzati tra i gruppi di trattamento e controllo, per evitare la contaminazione incrociata. Redigere la soluzione di colorante probiotico nella siringa, invertire e scorrere con il dito per rimuovere le bolle e lo spazio vuoto nel volume all'interno della siringa. Disegnare sul pistone per liberare il liquido, dallo spazio morto degli aghi, e quindi deprimere lo stantuffo, per espellere bolle d'aria e d'aria, questo è importante per garantire, che nessuna bolla d'aria sia gavaged, nell'animale.
Regolare il volume desiderato nella siringa, per un giorno di vita due topi, non devono essere gavaged più di 30 microlitri. La marcatura nera che vedi sull'ago, indica la lunghezza massima, che l'ago può essere inserito nel mouse. Questa lunghezza si ottiene misurando esternamente, la lunghezza tra il muso e il processo xifoide.
Posizionare la siringa su una superficie sterile, rimuovere il cucciolo da gavaged dalla gabbia sperimentale e osservare i segni di salute. Questi segni di salute includono la respirazione regolare e la colorazione rosa della pelle. Posizionare il cucciolo sul foglio osservante sterile, sulla pastiglia riscaldante.
Lubrificare la superficie esterna dell'ago di alimentazione, utilizzando il solvente utilizzato per sciogliere il probiotico. Qui è acqua di destrosio, questo offre l'ingresso regolare dell'ago, nell'esofago dell'animale. Scruff il cucciolo per la pelle sul collo, usando il pollice e l'indice.
Afferrare la siringa nella mano dominante, in una posizione che consente di inserire l'ago e deprimere lo stantuffo senza regolare le dita. Inserire il bulbo dell'ago di alimentazione con un angolo di 45 gradi, fino a raggiungere la parte posteriore della bocca. Ruota la mano con l'ago lontano da te, tenendo in posizione il bulbo dell'ago, una volta che l'ago è semplice con il busto, inizierà a scivolare.
Assicurarsi che non sia applicata alcuna pressione aggiuntiva alla siringa, per stimolare il movimento. Il processo di deglutizione sarà lento e la pazienza è fondamentale. Man mano che il cucciolo invecchia, la deglutizione dell'ago diventerà sempre più veloce.
L'ago di alimentazione è stato pre-marcato, per evitare che il bulbo entri nello stomaco. Una volta che la marcatura si avvicina al muso, arrestare il movimento dell'ago e fornire lentamente la soluzione probiotica. Una volta completata la consegna, rimuovere lentamente l'ago.
Posizionare il mouse sulla pastiglia riscaldante e osservare per il recupero. Un riflesso ansimanti si risolve e la frequenza cardiaca aumenta, riappare una colorazione rosa sana e un riflesso ansimando irrisolto dopo 45 secondi, indica un gavage fallito e il topo deve essere eutanasiato. Il colorante di gavage dovrebbe essere visibile attraverso la pelle pallida, il colorante dovrebbe essere visibile solo nella zona, dove di solito si trova la macchia di latte.
Il confinamento al colorante allo stomaco, indica un gavage di successo. Se il colorante si trova nella cavità toracica o in qualsiasi altra cavità oltre allo stomaco, il topo deve essere eutanasiato, in quanto indica un gavage fallito. È necessaria una pressione minima, per scruffare un giorno di vita due topi.
I segni di scruffing a duro possono includere, incapacità di respirare, ansimante significativo e attaccare la lingua per una lunga durata. Alcuni suggerimenti per la procedura di gavaging, riposare la parte posteriore del dito delle mani trasandato, sul palmo della mano che tiene la siringa, questo assicura che la posizione dei cuccioli sia stabile, durante la procedura e l'ago, non si sposti all'interno dell'animale. Durante il gavage, il peso dell'ago, faciliterà lo scorrimento, consentirà all'ago di essere inghiottito dal cucciolo, senza esercitare alcuna pressione esterna.
Restituisci i cuccioli nella gabbia della diga e segui il monitoraggio secondo il tuo programma. Raccolta di campioni intestinali per l'analisi della colonizzazione. L'animale è stato eutanasiato umanamente, con metodi approvati nel protocollo sulla cura e l'uso degli animali.
Il tavolo chirurgico è rivestito con un tappetino assorbente sterile. Gli strumenti sono stati sterilizzati utilizzando 70 etanolo percentuale e una sterilizzazione a caldo a 250 gradi Celsius. Il servizio esterno dell'animale, viene disinfettato con 70% di etanolo.
Tagliare la pelle esterna usando forcep e forbici, in quattro quadranti, pur facendo particolare attenzione, per non lacerare il peritoneo. Infilare la pelle di lato in modo tale che il peritoneo sia ben esposto. Utilizzare diversi, nuovi strumenti sterili, per tagliare il peritoneo aperto, e prendere ulteriore cautela per non lacerare, gli organi interni in questo processo.
Individuare lo stomaco del cucciolo e bloccare il duodeno. Usando due forcep sterili, localizzare lo stomaco e individuare l'estremità duodenale dello stomaco. Clamp proprio all'incrocio, dello stomaco e del duodeno.
Utilizzare due nuove forcep sterili per far funzionare l'intestino, utilizzare un forcipe per tenere il duodeno, mentre si utilizza l'altro per strappare via qualsiasi tessuto connettivo, tenendo intatto l'intestino. Mentre ti dipani, posiziona l'intestino, sul tampone assorbente sterile che copre l'animale. Se ti capita di strappare l'intestino, durante la procedura di dipanatura, segna l'area in cui si è strappato, in modo che l'orientamento dell'intestino sia intatto.
Fissare all'estremità rettale ed effettuare tagli a entrambi i morsetti. Posizionare l'intestino intatto, su un foglio di alluminio marcato sterile nel giusto orientamento. Contrassegnare eventuali sezioni dell'intestino, necessarie per la successiva analisi.
Il DNA viene estratto da questi intestini, utilizzando una procedura di estrazione ottimizzata, e l'analisi QPCR viene eseguita per quantificare il probiotico. Il DNA viene estratto dall'intestino fresco o l'intestino può essere conservato, a -80 gradi Celsius utilizzando una scatola congelatore. Risultati rappresentativi, lactobacillus plantarium, colonizzazione con gavage ogni giorno e a giorni nostri.
Un segnale LP più elevato è stato osservato nell'intestino dei topi, gavaged a giorni diversi, rispetto ai topi gavaged ogni giorno. Così, sono stati costruiti esperimenti successivi, usando gavages a giorni diversi. Lactobacillus plantarum gavaged topi, co-alloggiati con topi nongati.
Segnali variabili di LP sono stati osservati in topi non trattati, che sono stati co-alloggiati con topi gavaged LP. La diffusione della colonizzazione dell'LP, è possibile con i compagni di lettiera, e quindi le condizioni di trattamento, sono state separate da gabbie per i nostri esperimenti successivi. Conclusione, questa procedura può essere utilizzata per fornire, quantità precise di qualsiasi liquido a topi appena nati.
Il campionamento dell'intestino può essere estrapolato, per esplorare i cambiamenti nel microbioma, attraverso altri metodi di analisi. Lo scopo di questo video è quello di fornire una piattaforma, per i ricercatori di utilizzare modelli di gavage del topo neonatale, per comprendere i meccanismi alla base degli effetti osservati, con la somministrazione precoce di probiotici. Un ringraziamento speciale al Kollmann Lab Team, The Animal Care Services dell'Università della Colombia britannica, per aver reso possibile questo studio.
