Пробиотические исследования у неонатальных мышей с использованием гаважа. Введение, этот видео протокол будет подробно установки и процедуры для gavaging пробиотики для неонатальной мыши, на его день жизни два. В этом протоколе также подробно описана стерильная коллекция кишечника для анализа микробиома кишечника.
Некоторые репрезентативные результаты, также включенные в этот протокол, вводят некоторые типы данных, которые могут быть получены из следовать этой процедуре. Внутриэзофагеальный гаваг неонатальной мыши, день жизни два. Поместите клетку плотины в тот же капот, где экспериментальные клетки помещаются на грелку, грелка установлена на среднем уровне, который составляет около 38 градусов по Цельсию.
Удалите почву гнездования из домашней клетки, руб гнездования с перчатками руки для передачи ароматов, гнездования материала на перчатку. Это уменьшает передачу иностранных ароматов, на щенка при работе. Это, в свою очередь, снижает риск оставления или каннибализации плотины из-за иностранных ароматов.
Когда щенков возвращают в домашнюю клетку, после процедуры. Создайте коническое гнездо и поместите его в новую и стерильную экспериментальную клетку, которая была предварительно разогрета. Перенесите всех щенков из домашней клетки в экспериментальную клетку.
Перемести щенков в коническое гнездование, в экспериментальную клетку. Удалите клетку плотины и поместите ее подальше от области гаваги. Это уменьшает стрессовые условия для плотины, предотвращая плотину от слушания щенка, делая процедуру.
Откройте упаковку шприца для легкого доступа. Удалите автоматическую канаву gavage кормления иглы, в стерильной манере, и прикрепить его к голове шприца. Иголку промывают 70%этанолом и водой перед автоклавом.
Различные наборы игл для кормления используются между лечебными и контрольных группами, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Нарисуйте раствор пробиотических красителей в шприц, инвертировать и щелкнуть пальцем, чтобы удалить пузырьки, и пустое пространство в объеме внутри шприца. Оттянуть на поршень, чтобы очистить жидкость, от игл мертвого пространства, а затем угнетать поршень, чтобы изгнать пузырьки воздуха и воздуха, это важно для обеспечения того, чтобы пузырьки воздуха не gavaged, в животное.
Отрегулируйте нужный объем в шприце, за день жизни две мыши, не более 30 микролитров должны быть gavaged. Черная маркировка, которую вы видите на игле, указывает на максимальную длину, что игла может быть вставлена в мышь. Эта длина получена путем внешнего измерения, длина между мордой и процессом xiphoid.
Поместите шприц вниз на стерильной поверхности, удалить щенка, чтобы быть gavaged из экспериментальной клетке, и наблюдать за признаками здоровья. Эти признаки здоровья включают, регулярное дыхание и розовая окраска кожи. Поместите щенка на стерильный наблюдательный лист, на грелку.
Смазка внешней поверхности кормления иглы, используя растворитель, используемый для растворения пробиотика. Здесь это декстроза воды, это средства плавного входа иглы, в пищевод животного. Scruff щенка по коже на шее, используя большой палец и указательный палец.
Возьмите шприц в доминирующей руке, в положении, которое позволяет вставить иглу, и угнетать поршень, не регулируя пальцы. Вставьте луковицу кормления иглы под углом 45 градусов, пока она не достигнет задней части рта. Pivot руку с иглой от вас, держа луковицу иглы на месте, как только игла равнине с туловищем, он начнет скользить.
Убедитесь, что не дополнительное давление применяется к шприцу, чтобы стимулировать движение. Процесс глотания будет медленным, и терпение является ключевым фактором. Как щенок становится старше глотания иглы, станет быстрее и проще.
Кормление иглы была предварительно отмечена, чтобы предотвратить луковицу от входа в желудок. Как только маркировка приближается морда, остановить движение иглы, и медленно доставить пробиотический раствор. Как только доставка завершена, удалите иглу медленно.
Поместите мышь на грелку и наблюдайте за восстановлением. А задыхаясь рефлекс разрешает и пульс поднимается, здоровая розовая окраска появляется, и нерешенные задыхаясь рефлекс после 45 секунд, указывает на не удалось gavage и мышь должна быть усыпана. Гаваж краситель должен быть виден через бледную кожу, краситель должен быть виден только в области, где молоко пятно обычно находится.
Заключение красителя в желудок, указывает на успешный gavage. Если краситель находится в грудной полости, или любой другой полости, чем желудок, мышь должна быть усыпана, так как это указывает на неудавшийся гаваг. Минимальное давление необходимо, чтобы потертости в день жизни две мыши.
Признаки scruffing трудно может включать в себя, неспособность дышать, значительные задыхаясь, и торчащие язык в течение длительного времени. Несколько предложений для gavaging процедуры, отдых задней части пальца scruffing руки, на ладони, держа шприц, это гарантирует, что положение щенков стабильна, во время процедуры и иглы, не перемещается внутри животного. Во время gavage, вес иглы, облегчит сползание, позволит игле быть проглоченным щенком, без приложить любое внешнее давление.
Верните щенков в клетку плотины, и следить за мониторингом в соответствии с вашим графиком. Сбор кишечных образцов для анализа колонизации. Это животное было гуманно усыпано методами, утвержденными в Протоколе по уходу за животными и использованию.
Хирургический стол облицован стерильным абсорбентным ковриком. Инструменты были стерилизованы с использованием 70 процентов этанола, и горячей стерилизации бить при 250 градусов по Цельсию. Внешняя служба животного, дезинфицируется 70 процентов этанола.
Разрежьте внешнюю кожу с помощью миппов и ножниц, на четыре квадранта, принимая при этом дополнительную осторожность, чтобы не рваные брюшной полых. Tuck кожи в сторону так, что, брюшной полых хорошо подвергается. Используйте различные, новые стерильные инструменты, чтобы сократить брюшной открытый, и принять дополнительную осторожность, чтобы не рваные, внутренние органы в этом процессе.
Найдите желудок щенка, и зажим на двенадцатиперстной части. Используя два стерильных типса, найдите желудок и найдите двенадцатиперстной части желудка. Зажим прямо на перекрестке, желудка и двенадцатиперстной части.
Используйте два новых стерильных типсов для запуска кишечника, использовать один forcep провести на двенадцатиперстной кишке, в то время как с помощью другого, чтобы сорвать любой соединительной ткани, держа кишечник нетронутыми. Как вы разгадать, поместите кишечник, на стерильные абсорбента площадку, покрывающую животное. Если вам случится рип кишечника, во время процедуры распутывания, пометить области, на которой он разорвал, так что ориентация кишечника нетронутыми.
Зажим на ректальный конец, и сделать разрезы на обоих зажимов. Поместите нетронутую кишку, на стерильную маркированную алюминиевую фольгу в правильную ориентацию. Отметите любые участки кишечника, необходимые для последующего анализа.
ДНК извлекается из этих кишечников, используя оптимизированную процедуру экстракции, и анализ ПЦР делается для количественной оценки пробиотика. ДНК извлекается из свежего кишечника, или кишечник может храниться, при отрицательном 80 градусов по Цельсию с помощью морозильной камеры. Репрезентативные результаты, лактобактерии растений, колонизация с гаважем каждый день и через день.
Более высокий сигнал LP наблюдался в кишечнике мышей, gavaged через день, по сравнению с мышами gavaged каждый день. Таким образом, последующие эксперименты были построены, используя gavages через день. Lactobacillus plantarum gavaged мышей, совместно размещенных с ungavaged мышей.
Переменные сигналы LP наблюдались у необработанных мышей, которые были совместно размещены с LP gavaged мышей. Распространение колонизации LP, по возможности с товарищами помета, и таким образом условия обработки, были отделены клетками для наших затем экспериментов. Вывод, эта процедура может быть использована для доставки, точное количество любой жидкости для новорожденных мышей.
Выборка кишечника может быть экстраполирована, чтобы исследовать изменения в микробиоме, с помощью других методов анализа. Область этого видео заключается в том, чтобы обеспечить платформу, для исследователей, чтобы использовать неонатальные модели мыши gavage, чтобы понять механизмы, стоящие за наблюдаемых эффектов, с ранним введения пробиотиков. Особая благодарность команде лаборатории Коллманн, Службе по уходу за животными Университета Британской Колумбии, за то, что она делает это исследование возможным.
