Estudos probióticos, em camundongos neonatais usando gavage. Introdução, este protocolo de vídeo detalhará a configuração e procedimento para gavaging probióticos para um rato neonatal, em seu dia de vida dois. A coleta estéril de intestinos, para análise de microbioma intestinal, também está detalhada neste protocolo.
Alguns resultados representativos também estão incluídos neste protocolo, para introduzir alguns dos tipos de dados, que podem ser derivados do segui-lo. Gavage intra-esôfago de camundongo neonatal, dia de vida dois. Coloque a gaiola da represa no mesmo capô onde as gaiolas experimentais são colocadas na almofada de aquecimento, a almofada de aquecimento é definida para nível médio, que é de aproximadamente 38 graus Celsius.
Remova alguns ninhos de solo da gaiola de casa, esfregue o ninho com as mãos enluvadas para transferir os aromas do material de aninhamento para a luva. Isso reduz a transferência de perfumes estrangeiros para o filhote quando manuseado. Isso, por sua vez, reduz o risco de abandono ou canibalização, pela barragem devido a cheiros estranhos.
Quando os filhotes são devolvidos à gaiola de casa, após o procedimento. Crie um ninho de retenção em forma cônica, e coloque-o na nova e estéril gaiola experimental, que foi pré-aquecida. Transfira todos os filhotes da jaula para a jaula experimental.
Mova os filhotes para o ninho cônico, na gaiola experimental. Retire a gaiola da represa e coloque-a, longe da área de gavaging. Isso reduz as condições estressantes para a barragem, impedindo que a barragem ouvisse o filhote, fazendo o procedimento.
Abra a embalagem da seringa para fácil acesso. Remova a agulha de alimentação de gavage de clave automática, de forma estéril, e anexe-a à cabeça da seringa. A agulha é lavada com 70% de etanol, e água, antes de autoclaving.
Diferentes conjuntos de agulhas de alimentação são usados entre os grupos de tratamento e controle, para evitar contaminação cruzada. Desenhe a solução de corante probiótico na seringa, inverta e filme com o dedo para remover bolhas e esvazie o espaço no volume dentro da seringa. Retire o êmbolo para limpar o líquido, do espaço morto das agulhas, e depois deprimir o êmbolo, para expulsar as bolhas de ar e ar, isso é importante para garantir que nenhuma bolha de ar seja gavaged, para o animal.
Ajuste o volume desejado na seringa, para um dia de vida dois mouses, não mais do que 30 microliters devem ser gavaged. A marca preta que você vê na agulha, indica o comprimento máximo, que a agulha pode ser inserida no mouse. Este comprimento é obtido por medição externa, o comprimento entre o focinho e o processo xiphoide.
Coloque a seringa em uma superfície estéril, remova o filhote para ser gavaged da gaiola experimental e observe para sinais de saúde. Esses sinais de saúde incluem respiração regular e coloração rosa da pele. Coloque o filhote na folha observadora estéril, na almofada de aquecimento.
Lubrifique a superfície externa da agulha de alimentação, utilizando o solvente usado para dissolver o probiótico. Aqui é água dextrose, esta instala a entrada suave da agulha, no esôfago do animal. Esmague o filhote pela pele no pescoço, usando o polegar e o dedo indicador.
Segure a seringa na mão dominante, em uma posição que permita inserir a agulha e deprimir o êmbolo sem ajustar os dedos. Insira a lâmpada da agulha de alimentação em um ângulo de 45 graus, até atingir a parte de trás da boca. Gire a mão com a agulha longe de você, enquanto segura a lâmpada da agulha no lugar, uma vez que a agulha esteja clara com o tronco, ela começará a deslizar.
Certifique-se de que nenhuma pressão extra seja aplicada na seringa, para estimular o movimento. O processo de deglutição será lento, e a paciência é fundamental. À medida que o filhote envelhece, a deglutição da agulha se tornará mais rápida e fácil.
A agulha de alimentação foi pré-marcada, para evitar que a lâmpada entre no estômago. Uma vez que a marcação se aproxime do focinho, prenda o movimento da agulha, e lentamente entregue a solução probiótica. Quando a entrega estiver completa, remova a agulha lentamente.
Coloque o mouse na almofada de aquecimento e observe para recuperação. Um reflexo ofegante se resolve e a frequência cardíaca sobe, uma coloração rosa saudável reaparece, e reflexo ofegante não resolvido após 45 segundos, indica um gavage falhou e o rato deve ser eutanizado. O corante de gavage deve ser visível através da pele pálida, o corante deve ser visível apenas na área, onde a mancha de leite é geralmente encontrada.
O confinamento do corante ao estômago indica um gavage bem sucedido. Se o corante for encontrado na cavidade torácica, ou em qualquer outra cavidade que não o estômago, o rato deve ser eutanizado, pois indica um gavage falho. É necessária pressão mínima para passar um dia de vida com dois ratos.
Sinais de scruffing ao hard podem incluir, incapacidade de respirar, ofegante significativo, e enfiar a língua para fora por uma longa duração. Algumas sugestões para o procedimento de gavaging, descanse a parte de trás do dedo das mãos, na palma da mão segurando a seringa, isso garante que a posição dos filhotes seja estável, durante o procedimento e a agulha, não seja movida dentro do animal. Durante o gavage, o peso da agulha facilitará o deslizamento, permitirá que a agulha seja engolida pelo filhote, sem exercer qualquer pressão externa.
Devolva os filhotes para a gaiola da represa, e acompanhe o monitoramento conforme sua agenda. Coleta de amostras intestinais para análise de colonização. O animal foi humanamente eutanizado, por métodos aprovados no Protocolo de Cuidado e Uso de Animais.
A mesa cirúrgica é forrada com um tapete absorvente estéril. As ferramentas foram esterilizadas usando 70 porcentos de etanol, e uma esterilização de batida quente a 250 graus Celsius. O serviço externo do animal é desinfetado com 70% de etanol.
Corte a pele externa usando fórceps e tesouras, em quatro quadrantes, enquanto toma cuidado extra, para não lacerar o peritônio. Coloque a pele ao lado de tal forma que o peritônio esteja bem exposto. Use ferramentas diferentes e estéreis, para cortar o peritônio aberto, e tome cuidado extra para não lacerar os órgãos internos nesse processo.
Localize o estômago do filhote, e aperte o duodeno. Usando dois fórceps estéreis, localize o estômago e localize a extremidade duodenal do estômago. Aperte bem no cruzamento, no estômago e no duodeno.
Use duas novas fórceps estéreis para executar os intestinos, use um forcep para segurar o duodeno, enquanto usa o outro para rasgar qualquer tecido conjuntivo, segurando os intestinos intactos. À medida que você se desvenda, coloque os intestinos.na almofada absorvente estéril que cobre o animal. Se acontecer de você rasgar os intestinos, durante o procedimento de desvendamento, marque a área em que ele rasgou, de modo que a orientação do intestino está intacta.
Aperte na extremidade retal, e faça cortes em ambos os grampos. Coloque o intestino intacto, em uma folha de alumínio marcada estéril na orientação certa. Marque todas as seções do intestino, necessárias para sua análise subsequente.
O DNA é extraído desses intestinos, usando um procedimento de extração otimizado, e a análise qpcr é feita para quantificar o probiótico. O DNA é extraído de intestinos frescos, ou os intestinos podem ser armazenados, a 80 graus Celsius negativos usando uma caixa de congelador. Resultados representativos, lactobacillus plantarium, colonização com gavage todos os dias e dia sim, dia não.
Um sinal de LP mais alto foi observado nos intestinos de camundongos, gavaged a cada dois dias, em comparação com ratos gavaged todos os dias. Assim, foram construídos experimentos subsequentes, utilizando gavages a cada dois dias. Lactobacillus plantarum gavaged ratos, co-alojados com ratos ungavaged.
Sinais variáveis de LP foram observados em camundongos não tratados, que foram co-alojados com camundongos LP gavaged. A colonização disseminada do LP, é possível com os companheiros de ninhada, e assim as condições de tratamento, foram separadas por gaiolas para nossos experimentos subsequentes. Conclusão, este procedimento pode ser usado para fornecer quantidades precisas de qualquer líquido para camundongos recém-nascidos.
A amostragem dos intestinos pode ser extrapolada, para explorar as mudanças no microbioma, através de outros métodos de análise. O escopo deste vídeo é fornecer uma plataforma, para que os pesquisadores utilizem modelos neonatais de gavage de camundongos, para entender os mecanismos por trás dos efeitos observados, com a administração precoce de probióticos. Um agradecimento especial à equipe do Kollmann Lab, the Animal Care Services da Universidade da Colômbia Britânica, por tornar este estudo possível.
