Este método puede ayudar a responder a varias preguntas clave involucradas en la producción de oligosacáridos de leche humana. En primer lugar, ¿cuánto del producto tengo? Y en segundo lugar, ¿cuál es la vinculación específica de carbohidratos?
El objetivo aquí es simplificar y acelerar el proceso de cuantificación y caracterización de estos oligosacáridos de leche humana. Este método tiene dos ventajas sobre el estado actual de la técnica. En primer lugar, es susceptible de detección de alto rendimiento.
Por lo tanto, usted puede imaginar probar miles de condiciones diferentes o tal vez incluso una biblioteca de enzimas de síntesis en un día utilizando esta técnica. Además, utiliza la especificidad única del sustrato que la naturaleza ha evolucionado en enzimas para darnos información sobre la vinculación de carbohidratos de esos oligosacáridos. Creemos que este método puede mejorar la producción de oligosacáridos de leche humana, lo que a su vez puede conducir a una fórmula infantil de mejor calidad que imita más estrechamente la leche materna humana y ayudar a cerrar la brecha entre los bebés alimentados con leche materna y alimentados con fórmula.
Se recomienda la discreción del usuario a la hora de decidir qué método utilizar para la eliminación de lactosa en función del costo, el rendimiento y la disponibilidad del equipo. Se debe tener cuidado para garantizar una eliminación óptima de la lactosa. El día antes del experimento, semilla 5 mililitros de LB medio complementado con kanamicina y carmecilina de una colonia bacteriana fresca utilizando técnicas estériles.
Incubar todas las culturas durante la noche a 37 grados centígrados con agitación. Al día siguiente, transfiera 50 microlitros de un cultivo nocturno a cinco mililitros de medios LB M9 frescos con kanamicina y carenicillina. Incubar a 37 grados centígrados con temblor continuo hasta que el cultivo haya alcanzado un OD600 entre el punto cero cinco y el cero punto siete.
En primer lugar, transfiera los cultivos nocturnos en un tubo de cinco mililitros y centrifuga a 12.500 veces g durante un minuto. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de 1x PBS para preparar una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión de una sola célula a tubos de fax.
Utilice un citómetro de flujo para excitar GFP y recopilar los niveles de fluorescencia FITC como se describe en el protocolo de texto. Para hacer una curva de calibración, haga de ocho a 10 diluciones del estándar 2'FL en el rango entre cero y 2500 miligramos por litro. Cultivo de las células de biodetección 2'FL e inducirlas con las diluciones estándar como se describe en el protocolo de texto.
Comience una cultura de una cepa productora de 2'FL en cinco mililitros de medios LB y creció durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, la subcultura en 1% en 250 mililitros de medios mínimos preparados y añadir glicerol a una concentración final de 10 gramos por litro. Incubar a 37 grados centígrados hasta que el cultivo alcance y OD600 entre el punto cero cinco y el cero punto siete.
A continuación, añadir IPTG a una concentración final de punto cero cinco milimolar y lactosa a una concentración final de dos gramos por litro. Incubar a 37 grados centígrados con agitación continua durante 24 horas. Al día siguiente, transfiera el cultivo nocturno a tubos estériles de 50 mililitros y centrífuga a 900 g durante 15 minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en agua desionizada. Repita este lavado tres veces para eliminar cualquier lactosa residual. Después de esto, re-suspender el pellet en cinco mililitros de agua desionizada.
Coloque las células sobre hielo y use un sonicador a 30% de potencia en pulsos de 30 segundos para anliceer la suspensión celular. Centrifugar las células de lesed a 2.000 g durante 25 minutos. Retire el sobrenadante y páselo a través de un filtro estéril.
Almacene el sobrenadante filtrado a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para analizar. A continuación, inocular un cultivo de células de biodetección 2'FL. En la fase de registro medio, induzca las células con el izado celular a concentraciones equivalentes a las de los 2'FL utilizados para realizar la curva de calibración.
Realice la calibración como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, ejecute las muestras en un citómetro de flujo. Genere una curva de respuesta a la dosis trazando la salida de fluorescencia con la concentración de oligosacáridos y compare la respuesta de las normas al licato celular.
En primer lugar, disolver la beta galactosidasa alfalizada de FL a 1.000 unidades por mililitro en cloruro de magnesio milimolar. Para determinar la concentración óptima de enzima necesaria, cultivar un inóculo de 2'FL células de biodetección y en la fase de registro medio, inducir con lactosa y 2'FL. A 100 cultivos de microlitros, agregue cantidades variables de beta galactosidasa hasta 12 unidades.
Deje que las culturas crezcan de la noche a la mañana a 37 grados centígrados con temblores continuos. Mida la fluorescencia como se describe en el protocolo de texto y calcule las unidades óptimas de enzimas necesarias determinando la concentración mínima de enzimas para lograr la atenuación deseada de la señal. A 2'FL células productoras cultivadas durante 24 horas añadir las unidades óptimas de beta galactosidasa e incubar durante la noche a 37 grados Celsius, determinar el título 2'FL como se describió anteriormente.
En primer lugar, inicie un cultivo de 25 mililitros de una cepa productora de 2'FL. Una vez que la cepa se induce en la fase de registro medio, incubar el cultivo a 37 grados centígrados durante 24 horas. A continuación, inocular una cultura E.coli BL21 en medios LB.
Crecer a la fase de registro medio a 37 grados Celsius y luego añadir 15 mililitros de esta cultura a la cultura 24 horas 2'FL. Incubar a 37 grados centígrados durante tres horas. A continuación, determine el título 2'FL como se describió anteriormente.
Para empezar, inicie un cultivo de 25 mililitros de una cepa productora de 2'FL. Una vez que la cepa se induce en la fase de registro medio, incubar el cultivo a 37 grados centígrados durante 24 horas. Añadir dos volúmenes de 100% etanol al cultivo y agitar bien.
Incubar a 37 grados centígrados durante cuatro horas. A continuación, centrifugar la suspensión a 900 veces g durante 15 minutos. Recoger el sobrenadante e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados para precipitar la lactosa.
Pase la solución a través del papel de filtro para eliminar la lactosa precipitada. Recoja el filtrado que contiene el lesato celular y determine el título 2'FL como se describió anteriormente. En este estudio, se utiliza una estrategia de alto rendimiento para la detección específica de enlaces de oligosacáridos de leche humana fucosilados.
Esto se logra mediante la construcción de biosensores de células enteras mediante la ingeniería genética E. coli que, tras la inducción con glicanos específicos, responden con una señal fluorescente. La señal fluorescente en diferentes condiciones de inducción analizadas en un citómetro de flujo, muestra sobre un aumento de 100 veces en la fluorescencia con el biosensor 2'FL en comparación con el control vectorial solamente o el biosensor para 3'FL. Esto muestra la alta especificidad de la vinculación del biosensor.
La sensibilidad del ensayo se puede determinar generando una curva de respuesta a la dosis con diferentes niveles de carbohidratos. El rango lineal dinámico de detección 2'FL, se ve entre 40 y 400 miligramos por litro y el límite de detección es de cuatro miligramos por litro. Este ensayo se puede llevar a cabo en el transcurso de una jornada laboral como se ve en las mediciones de disparo rápido de la dinámica de la expresión del reportero.
Las células de biodetección se pueden utilizar para detectar y cuantificar 2'FL a partir de una cepa de producción de 2'FL diseñada utilizando una serie de estrategias para reducir la señal de lactosa exógena de modo que la señal leída se corresponda directamente con la concentración de 2'FL. Una estrategia es degradar enzimáticamente la lactosa utilizando una beta galactosidasa que no actúa sobre la lactosa modificada. Otra estrategia utilizó etanol que no sólo precipita selectivamente la lactosa, sino que también ele las células del productor ya que la lysis de las células es un flujo de paso hacia abajo necesario.
Finalmente, el método más eficaz pero lento es peletizar y lavar las células antes de la lysis celular para liberar el 2'FL intracelular. Una vez que establecemos este método, pudimos ampliar el repertorio de dianas oligosacáridas utilizando diferentes enzimas. Actualmente, podemos detectar nueve oligosacáridos diferentes y estamos trabajando en más.
Al optimizar este ensayo, notamos que la robustez de nuestras enzimas nos permitía elaborar una técnica que da una lectura específica de un enlace en unos cinco minutos. Aunque ninguno de los reactivos utilizados aquí es particularmente peligroso, aquellos que utilizan este método deben seguir los procedimientos estándar de biopeligros y biocontención, incluido el uso adecuado de EPI.
