Cette méthode peut aider à répondre à plusieurs questions clés impliquées dans la production d’oligosaccharides de lait humain. Tout d’abord, quelle quantité de produit ai-je? Et deuxièmement, quel est le lien spécifique hydrate de carbone?
L’objectif ici est de simplifier et d’accélérer le processus de quantification et de caractérisation de ces oligosaccharides de lait humain. Cette méthode présente deux avantages par rapport à l’état actuel de l’art. Tout d’abord, il est agréable à un criblage à haut débit.
Ainsi, vous pouvez imaginer tester des milliers de conditions différentes ou peut-être même une bibliothèque d’enzymes de synthèse en une seule journée en utilisant cette technique. En outre, il utilise la spécificité unique du substrat que la nature a évolué en enzymes pour nous donner des informations sur le lien glucides de ces oligosaccharides. Nous croyons que cette méthode peut améliorer la production d’oligosaccharides de lait humain, ce qui peut à son tour conduire à des préparations pour nourrissons de meilleure qualité qui imitent plus étroitement le lait maternel humain et aident à combler l’écart entre les bébés allaités et nourris au lait maternisé.
La discrétion de l’utilisateur est recommandée pour décider quelle méthode utiliser pour l’élimination du lactose en fonction du coût, du débit et de la disponibilité de l’équipement. Il faut prendre soin d’assurer une élimination optimale du lactose. La veille de l’expérience, les graines de 5 millilitres de LB moyen complété par la kanamycine et la carbenicilline d’une colonie bactérienne fraîche en utilisant des techniques stériles.
Incubez toutes les cultures du jour au lendemain à 37 degrés Celsius avec agitation. Le lendemain, transférez 50 microlitres d’une culture nocturne en cinq millilitres de médias LB M9 frais avec kanamycine et carbenicilline. Incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses continues jusqu’à ce que la culture a atteint un OD600 entre zéro point cinq et zéro point sept.
Tout d’abord, transférer les cultures de nuit en un seul point cinq tubes millilitres et centrifugeuse à 12, 500 fois g pendant une minute. Jetez le supernatant et suspendez la pastille en 500 microlitres de 1x PBS pour préparer une suspension à cellule unique. Transférer la suspension d’une seule cellule dans des tubes à télécopieur.
Utilisez un cytomètre d’écoulement pour exciter GFP et recueillir les niveaux de fluorescence FITC tels que décrits dans le protocole de texte. Pour faire une courbe d’étalonnage, faire huit à 10 dilutions de la norme 2'FL dans la gamme entre zéro et 2500 milligrammes par litre. Culturez les cellules de biodétection 2'FL et induisez-les avec les dilutions standard décrites dans le protocole de texte.
Commencez une culture d’une souche de production de 2'FL en cinq millilitres de médias LB et cultivez-la du jour au lendemain à 37 degrés Celsius. Le lendemain, sous-culture à 1% dans 250 millilitres de médias minimaux préparés et ajouter du glycérol à une concentration finale de 10 grammes par litre. Incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la culture atteint et OD600 entre zéro point cinq et zéro point sept.
Ajouter ensuite l’IPTG à une concentration finale de zéro point cinq millimolaire et lactose à une concentration finale de deux grammes par litre. Incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses continues pendant 24 heures. Le lendemain, transférez la culture de la nuit dans des tubes stériles de 50 millilitres et une centrifugeuse à 900 fois g pendant 15 minutes.
Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille dans de l’eau déionisée. Répétez ce lavage trois fois pour éliminer tout lactose résiduel. Après cela, suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres d’eau déionisée.
Placez les cellules sur la glace et utilisez un sonicateur à 30% de puissance en impulsions de 30 secondes pour lyser la suspension cellulaire. Centrifugeuse les cellules lysées à 2000 fois g pendant 25 minutes. Retirez le surnatant et passez-le à travers un filtre stérile.
Conserver le surnatant filtré à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à analyser. Ensuite, inoculer une culture de cellules de biodétection 2'FL. À la phase médiane, induire les cellules avec la cellule lysate à des concentrations équivalentes à celles de ces 2'FL utilisé pour faire la courbe d’étalonnage.
Effectuez l’étalonnage tel qu’il est décrit dans le protocole de texte. Après cela, exécuter les échantillons sur un cytomètre d’écoulement. Générer une courbe de réponse à la dose en traçant la sortie de fluorescence par rapport à la concentration d’oligosaccharide et comparer la réponse des normes au lysate cellulaire.
Tout d’abord, dissoudre fl alphalyzed bêta galactosidase à 1000 unités par millilitre dans un chlorure de magnésium millimolaire. Pour déterminer la concentration optimale d’enzymes nécessaires, cultivez un inoculum de cellules de biodétection 2'FL et à la phase médiane, induire avec du lactose et 2'FL. À 100 cultures de microlitres, ajoutez des quantités variables de bêta galactosidase jusqu’à 12 unités.
Laissez les cultures se développer du jour au lendemain à 37 degrés Celsius avec des secousses continues. Mesurer la fluorescence telle que décrite dans le protocole textuel et calculer les unités optimales d’enzymes nécessaires en déterminant la concentration minimale d’enzymes pour atteindre l’atténuation souhaitée du signal. À 2'FL cellules productrices cultivées pendant 24 heures ajouter les unités optimales de bêta galactosidase et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius, déterminer le titre 2'FL comme décrit précédemment.
Tout d’abord, commencer une culture de 25 millilitres d’une souche productrice de 2'FL. Une fois que la souche est induite à la phase médiane, incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, inoculer une culture E.coli BL21 dans les médias LB.
Poussez-le à mi-phase de notation à 37 degrés Celsius puis ajoutez 15 millilitres de cette culture à la culture 24 heures 2'FL. Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, déterminez le titre 2'FL tel que décrit précédemment.
Pour commencer, commencez une culture de 25 millilitres d’une souche productrice de 2'FL. Une fois que la souche est induite à la phase médiane, incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ajouter deux volumes de 100% d’éthanol à la culture et bien trembler.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Ensuite, centrifugez la suspension à 900 fois g pendant 15 minutes. Recueillir le supernatant et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius pour précipiter le lactose.
Passez la solution à travers du papier filtre pour éliminer le lactose précipité. Recueillir le filtrate qui contient la cellule lysate et de déterminer le titre 2'FL comme décrit précédemment. Dans cette étude, une stratégie à haut débit est utilisée pour la détection spécifique de liaison des oligosaccharides fucosylated de lait humain.
Ceci est accompli en construisant des bio-capteurs cellulaires entiers en génie génétique E.Coli qui, lors de l’induction avec des glycanes spécifiques, répondent par un signal fluorescent. Le signal fluorescent dans différentes conditions d’induction tel qu’analysé sur un cytomètre d’écoulement, montre plus d’une augmentation de 100 fois de la fluorescence avec le bio-capteur 2'FL par rapport au seul vecteur de contrôle ou le bio-capteur pour 3'FL. Cela montre la spécificité de liaison élevée du bio-capteur.
La sensibilité de l’essai peut être déterminée en générant une courbe de réponse de dose avec des niveaux variables d’hydrate de carbone. La plage linéaire dynamique de détection 2'FL, est considérée comme se situe entre 40 et 400 milligrammes par litre et la limite de détection est de quatre milligrammes par litre. Cet essai peut être effectué au cours d’une journée de travail comme on le voit dans les mesures snap shot de la dynamique de l’expression des journalistes.
Les cellules de biodétection peuvent être utilisées pour détecter et quantifier 2'FL à partir d’une souche de producteur de 2'FL d’ingénierie utilisant un certain nombre de stratégies pour réduire le signal du lactose exogène de sorte que le signal lu correspondrait directement à la concentration de 2'FL. Une stratégie consiste à dégrader enzymatiquement le lactose à l’aide d’une bêta galactosidase qui n’agit pas sur le lactose modifié. Une autre stratégie a utilisé l’éthanol qui non seulement précipite sélectivement le lactose, mais lyse également les cellules productrices puisque la lyse des cellules est une étape nécessaire vers le bas du cours d’eau.
Enfin, la méthode la plus efficace mais la plus longue est de pelleter et laver les cellules avant la lyse cellulaire pour libérer l’intracellulaire 2'FL. Une fois que nous avons établi cette méthode, nous avons été en mesure d’élargir le répertoire des cibles oligosaccharide en utilisant différentes enzymes. Actuellement, nous pouvons détecter neuf oligosaccharides différents et nous travaillons sur d’autres.
Tout en optimisant cet essai, nous avons remarqué que la robustesse de nos enzymes nous a permis de trouver une technique qui donne un lien spécifique lu en environ cinq minutes. Bien qu’aucun des reagents utilisés ici ne soit particulièrement dangereux, ceux qui utilisent cette méthode devraient suivre des procédures standard de biodanger et de bioconférence, y compris le port d’EPI approprié.
