Этот метод может помочь ответить на несколько ключевых вопросов, связанных с производством молока человека олигосахаридов. Во-первых, сколько продукта у меня есть? А во-вторых, какова конкретная углеводная связь?
Цель здесь состоит в том, чтобы упростить и ускорить процесс количественной оценки и характеристики этих человеческих олигосахаридов молока. Этот метод имеет два преимущества по сравнению с современным состоянием. Во-первых, это подходят для высокой пропускной способности скрининга.
Таким образом, вы можете себе представить тестирование тысяч различных условий или, возможно, даже библиотека ферментов синтеза в один день с помощью этой техники. Кроме того, он использует уникальную специфику субстрата, что природа развивалась в ферментах, чтобы дать нам информацию о углеводной связи этих олигосахаридов. Мы считаем, что этот метод может улучшить производство молока человека олигосахаридов, что, в свою очередь, может привести к улучшению качества детского питания, что более тесно имитирует грудное молоко человека и помочь закрыть разрыв между грудным вскармливанием и формулы кормили младенцев.
Пользователь усмотрению рекомендуется при принятии решения о том, какой метод использовать для удаления лактозы на основе стоимости, пропускной способности и наличия оборудования. Следует позаботиться о оптимальном удалении лактозы. За день до эксперимента семена 5 миллилитров ЛБ среды дополнены канамицином и карбенициллином из свежей бактериальной колонии с использованием стерильных методов.
Инкубировать все культуры ночь на 37 градусов по Цельсию с волнением. На следующий день, передача 50 микролитров ночной культуры в пять миллилитров свежих СРЕДСТВ массовой информации LB M9 с канамицином и карбенициллином. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с непрерывной тряской, пока культура не достигла OD600 между нулевой точкой пять и ноль точки семь.
Во-первых, перенесите ночные культуры в одну точку пять миллилитров труб и центрифуг в 12500 раз г в течение одной минуты. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в 500 микролитров 1x PBS, чтобы подготовить одноклеточную подвеску. Перенесите одноклеточную подвеску на факсы.
Используйте цитометр потока для возбуждения GFP и сбора уровней флуоресценции FITC, как указано в текстовом протоколе. Чтобы сделать кривую калибровки, сделайте от 8 до 10 разбавлений стандартных 2'FL в диапазоне от нуля до 2500 миллиграммов на литр. Культура 2'FL био-зондирования клеток и вызвать их со стандартными разбавления, как указано в текстовом протоколе.
Начните культуру 2'FL производства штамма в пяти миллилитров LB средств массовой информации и расти его в одночасье при 37 градусов по Цельсию. На следующий день субкультура на уровне 1%в 250 миллилитров подготовленных минимальных средств массовой информации и добавить глицерол в конечной концентрации 10 граммов на литр. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию, пока культура не достигнет и OD600 между нулевой точкой пять и ноль точки семь.
Затем добавьте IPTG к окончательной концентрации нулевой точки пять миллимоляра и лактозы до конечной концентрации в два грамма на литр. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с непрерывной тряской в течение 24 часов. На следующий день перенесите ночную культуру на стерильные 50 миллилитровых трубок и центрифуг при 900 раз г в течение 15 минут.
Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в деионизированной воде. Повторите это мыть три раза, чтобы удалить остатки лактозы. После этого повторно приостанавливайте гранулы в пяти миллилитров деионизированной воды.
Поместите клетки на лед и используйте звуковой на 30% мощности в 30 секунд импульсов, чтобы подозировать подвеску клетки. Центрифуга лисированных клеток на 2000 раз г в течение 25 минут. Удалите супернатант и перейдите его через стерильный фильтр.
Храните отфильтрованный супернатант при четырех градусах Цельсия до готовности к анализу. Далее, привить культуру 2'FL био-зондирования клеток. На фазе среднего журнала индуцировать клетки с лисями клетки в концентрациях, эквивалентных тем 2'FL, которые используются для калибровки кривой.
Выполните калибровку, изложенную в текстовом протоколе. После этого запустите образцы на цитометре потока. Создайте кривую реакции дозы, наплантовив выход флуоресценции против концентрации олигосахарида и сравните реакцию стандартов на лизат клетки.
Во-первых, растворить FL альфализе бета-галактозидазы до 1000 единиц на миллилитр в одном миллимолярный хлорид магния. Чтобы определить оптимальную концентрацию необходимого фермента, вырастите инокулум из 2'FL био-чувствуютых клеток и на фазе среднего журнала, индуцировать лактозой и 2'FL. К 100 культурам микролитров добавьте переменное количество бета-галактозидазы до 12 единиц.
Пусть культуры растут в одночасье при 37 градусах по Цельсию с непрерывной тряской. Измерьте флуоресценцию, описанную в текстовом протоколе, и рассчитайте оптимальные единицы фермента, необходимые для определения минимальной концентрации ферментов для достижения желаемого лечения сигнала. К 2'FL производящие клетки, выращенные в течение 24 часов, добавляют оптимальные единицы бета-галактозидазы и инкубируют на ночь при 37 градусах по Цельсию, определяют 2'FL titre, как описано ранее.
Во-первых, начать 25 миллилитров культуры 2'FL производства штамма. После того, как штамм индуцируется в середине этапа журнала, инкубировать культуру при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. Далее, привить E.coli BL21 культуры в LB СМИ.
Вырастить его до середины журнала фазы на 37 градусов по Цельсию, а затем добавить 15 миллилитров этой культуры в 24 часа 2'FL культуры. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение трех часов. Затем определите титр 2'FL, как описано ранее.
Для начала начните 25-миллилитровую культуру штамма 2'FL. После того, как штамм индуцируется в середине этапа журнала, инкубировать культуру на 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. Добавить два тома 100% этанола в культуру и хорошо встряхнуть.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов. Затем центрифугировать подвеску при 900 раз г в течение 15 минут. Соберите супернатант и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию, чтобы вызвать лактозу.
Перейдите раствор через фильтровальную бумагу, чтобы удалить осажденной лактозы. Соберите фильтрат, содержащий лизат клетки, и определите 2'FL titre, как описано ранее. В этом исследовании используется стратегия высокой пропускной способности для увязки конкретного обнаружения фукозилированного человеческого молока олигосахаридов.
Это достигается путем создания целых клеточных биосенсоров с помощью генно-инженерной E.Coli, которая при индукции с конкретными гликанами реагирует флуоресцентным сигналом. Флуоресцентный сигнал в различных условиях индукции, проанализированный на цитометре потока, показывает более чем в 100 раз увеличение флуоресценции с био-сенсором 2'FL по сравнению с вектором только контроль или био-сенсор для 3'FL. Это свидетельствует о высокой специфичности связи био-датчика.
Чувствительность анализа может быть определена путем генерации кривой реакции дозы с различными уровнями углеводов. Динамический линейный диапазон обнаружения 2'FL, как видно, между 40 и 400 миллиграммов на литр и предел обнаружения составляет четыре миллиграмма на литр. Этот анализ может быть проведен в течение рабочего дня, как видно из оснастки выстрел измерений динамики выражения репортера.
Био-зондирования клетки могут быть использованы для обнаружения и количественной оценки 2'FL от инженерии 2'FL производитель штамма с использованием ряда стратегий для уменьшения сигнала от экзогенной лактозы, так что сигнал зачитал будет непосредственно соответствовать концентрации 2'FL. Одна из стратегий заключается в том, чтобы энзиматично деградировать лактозу с помощью бета-галактозидазы, которая не действует на модифицированную лактозу. Другая стратегия использовала этанол, который не только выборочно осаждает лактозу, но и лизает клетки-производители, так как лиз клеток является необходимым шагом вниз по течению.
Наконец, наиболее эффективным, но трудоемким методом является гранулирование и мыть клетки до клеточного лиза, чтобы освободить внутриклеточный 2'FL. Как только мы установим этот метод, мы смогли расширить репертуар олигосахарида целей с использованием различных ферментов. В настоящее время мы можем обнаружить девять различных олигосахаридов, и мы работаем над более.
При оптимизации этого анализа, мы заметили, надежность наших ферментов позволило нам придумать метод, который дает связь конкретных зачитал примерно за пять минут. Хотя ни один из реагентов, используемых здесь, не является особенно опасным, те, кто использует этот метод, должны следовать стандартным процедурам биоопасности и биоконтента, включая ношение надлежащего СИЗ.
