この方法は、ヒト乳オリゴ糖の生産に関するいくつかの重要な質問に答えることができます。まず、製品の量はどれくらいですか?第二に、特定の炭水化物の結合は何ですか?
ここでの目標は、これらのヒト乳オリゴ糖を定量化し、特徴付けるプロセスを簡素化し、スピードアップすることです。この方法は、現在の最先端に対して2つの利点を有する。まず、ハイスループットスクリーニングに適しています。
だから, この技術を使用して、1 日で何千もの異なる条件、あるいはおそらく合成酵素のライブラリをテスト想像することができます。.また、自然が酵素で進化してきた独特の基質特異性を利用して、それらのオリゴ糖の炭水化物結合に関する情報を提供します。この方法は、ヒトの母乳オリゴ糖の生産を改善し、ヒトの母乳をより密接に模倣し、母乳と授乳中の赤ちゃんの間のギャップを埋めるのに役立つ、より質の高い乳児用フォーミュラにつながると考えています。
コスト、スループット、および機器の可用性に基づいてラクトース除去に使用する方法を決定する際には、ユーザーの裁量が推奨されます。最適な乳糖除去を確実にするために注意する必要があります。.実験の前日には、無菌技術を用いた新鮮な細菌コロニーからカナマイシンおよびカルベニシリンを添加したLB培地の種子5ミリリットル。
すべての文化を摂氏37度で一晩にインキュベートします。翌日、カナマイシンとカルベニシリンを用いて、一晩培養した50マイクロリットルを新鮮なLB M9培地の5ミリリットルに移す。培養がゼロポイント5とゼロポイント7の間のOD600に達するまで、連続的な揺れで摂氏37度でインキュベートします。
まず、一晩培養物を1ポイント5ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を12、500倍gで1分間移す。上清を捨て、1xPBSの500マイクロリットルでペレットを再懸濁し、単一の細胞懸濁液を調製する。単一セルのサスペンションをファクスチューブに移します。
フローサイトメーターを使用してGFPを励起し、テキストプロトコルで概説されているようにFITC蛍光レベルを収集します。キャリブレーションカーブを作るためには、1リットル当たり0〜2500ミリグラムの範囲で標準2'FLの8〜10希釈を行います。2'FLバイオセンシング細胞を培養し、テキストプロトコルで概説されているように、標準的な希釈液でそれらを誘導する。
LB培地の5ミリリットルで株を生産する2'FLの培養を開始し、摂氏37度で一晩成長させます。翌日、サブカルチャーは1%で250ミリリットルの最小限の培地を調製し、グリセロールを1リットル当たり10グラムの最終濃度に加える。培養が到達するまで摂氏37度でインキュベートし、ゼロポイント5とゼロポイント7の間でOD600をインキュベートします。
その後、ゼロポイント5ミリモルとラクトースの最終濃度にIPTGを加え、1リットル当たり2グラムの最終濃度にします。24時間連続揺れで摂氏37度でインキュベート。翌日、15分間900回gで無菌50ミリリットルチューブと遠心分離機に一晩培養を移す。
上清を捨て、脱イオン水でペレットを再び懸濁します。この洗浄を3回繰り返して、残ったラクトースを取り除きます。この後、ペレットを5ミリリットルの脱イオン水で再懸濁する。
細胞を氷の上に置き、30秒パルスで30%のパワーで超音波処理器を使用して細胞懸濁液を取り付けます。2,000回gで25分間、細胞を遠心分離する。上清を取り除き、滅菌フィルターを通します。
フィルター処理した上清を分析の準備ができるまで摂氏4度で保存します。次に、2'FLバイオセンシング細胞の培養を接種する。中対数相で、細胞のライセートを、較正曲線の作成に使用した2'FLと同等の濃度で誘導する。
テキストプロトコルに記載されているキャリブレーションを実行します。この後、フローサイトメーターでサンプルを実行します。蛍光量の出力をオリゴ糖濃度にプロットして用量応答曲線を生成し、細胞のリセートに対する標準の応答を比較します。
まず、FLα分解したβガラクトシダーゼを1ミリモル塩化マグネシウムに1ミリリットル当たり1,000単位に溶解する。必要な酵素の最適濃度を決定するには、2'FLバイオセンシング細胞の接種を成長させ、中対数相でラクトースと2'FLで誘導します。100マイクロリットルの培養物に、12単位までのベータガラクトシダーゼの可変量を加える。
連続的な揺れで37°Cで一晩文化を成長させてください。テキストプロトコルに記載されている蛍光を測定し、シグナルの所望の減衰を達成するために最小酵素濃度を決定することによって必要な酵素の最適単位を計算します。24時間成長した2'FL産生細胞に、βガラクトシダーゼの最適単位を加え、摂氏37度で一晩インキュベートし、前述のように2'FLの力を決定する。
まず、2'FL産生株の25ミリリットル培養を開始する。中対数相で菌株が誘導されたら、24時間摂氏37度で培養を行う。次に、LB培地で大腸菌BL21培養物を接種する。
摂氏37度で中ログ相に成長させ、24時間2'FL文化にこの文化の15ミリリットルを加えます。摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、前述のとおり 2'FL の titre を判別します。
まず、2'FL産生株の25ミリリットル培養を開始する。中対数相で菌株が誘導されたら、24時間摂氏37度で培養を行う。100%エタノールを2巻の培養物に加え、よく振ります。
摂氏37度で4時間インキュベートします。その後、懸濁液を900回gで15分間遠心する。上清を集め、摂氏4度で一晩インキュベートして乳糖を沈殿させます。
溶液を濾紙を通して、沈殿したラクトースを除去する。細胞のライセートを含む濾液を収集し、前述のように2'FLのtitreを決定します。本研究では、フコシル化ヒト乳オリゴ糖のリンケージ特異的検出にハイスループット戦略を用いる。
これは、特定のグリカンを誘導すると蛍光シグナルで応答する大腸菌を遺伝子工学することによって、全細胞バイオセンサーを構築することによって達成される。フローサイトメーターで分析した誘導の異なる条件下での蛍光シグナルは、3'FLの制御のみまたはバイオセンサーのベクターと比較して2'FLバイオセンサーを用いた蛍光の100倍以上の増加を示す。これは、バイオセンサーの高いリンケージ特異性を示す。
アッセイの感度は、炭水化物レベルの変化を伴う用量応答曲線を生成することによって決定することができる。2'FL検出の動的線形範囲は、1リットル当たり40〜400ミリグラムの間であると見られ、検出の限界は1リットル当たり4ミリグラムである。このアッセイは、レポーター表現のダイナミクスのスナップショット測定に見られるように、作業日の間に行うことができる。
バイオセンシング細胞は、読み出された信号が2'FL濃度に直接対応するように外因性ラクトースからの信号を減らすための多くの戦略を使用して、設計された2'FL生産者株から2'FLを検出し、定量化するために使用することができます。1つの戦略は、修飾乳糖に作用しないベータガラクトシダーゼを使用して乳糖を酵素的に分解することです。別の戦略は、ラクトースを選択的に沈殿させるだけでなく、細胞のライシスが必要なステップダウンストリームであるため、生産者細胞を分解するエタノールを利用した。
最後に、最も効果的だが時間のかかる方法は、細胞内2'FLを放出するために細胞の細胞をペレットに洗浄し洗浄することです。この方法を確立すると、異なる酵素を用いてオリゴ糖標的のレパートリーを拡大することができました。現在、9種類のオリゴ糖を検出することができ、より多くの作業を行っています。
このアッセイを最適化しながら、酵素の堅牢性により、約5分でリンケージ固有の読み出しを行う技術を考え出すようになりました。ここで使用される試薬はいずれも特に危険ではありませんが、この方法を使用する試薬は、適切なPPEの着用を含む標準的なバイオハザードおよびバイオ封じ込め手順に従う必要があります。
