Diese Methode kann helfen, mehrere Schlüsselfragen bei der Herstellung von Muttermilch-Oligosacchariden zu beantworten. Erstens, wie viel von dem Produkt habe ich? Und zweitens, was ist die spezifische Kohlenhydrat-Verbindung?
Das Ziel dabei ist, den Prozess der Quantifizierung und Charakterisierung dieser Menschlichen Milcholigosaccharide zu vereinfachen und zu beschleunigen. Diese Methode hat zwei Vorteile gegenüber dem aktuellen Stand der Technik. Erstens ist es für Einführ-Screenings mit hohem Durchsatz zugänglich.
Also, Sie können sich vorstellen, Tausende von verschiedenen Bedingungen oder vielleicht sogar eine Bibliothek von Syntheseenzymen an einem Tag mit dieser Technik zu testen. Außerdem nutzt es die einzigartige Substratspezifität, die die Natur in Enzymen entwickelt hat, um uns Informationen über die Kohlenhydratverknüpfung dieser Oligosaccharide zu geben. Wir glauben, dass diese Methode die Produktion von Muttermilch-Oligosacchariden verbessern kann, was wiederum zu einer qualitativ besseren Säuglingsnahrung führen kann, die die Muttermilch besser nachahmt und dazu beiträgt, die Kluft zwischen gestillten und formelgefütterten Babys zu schließen.
Benutzer Diskretion wird empfohlen, wenn sie entscheiden, welche Methode für die Laktose-Entfernung auf der Grundlage von Kosten, Durchsatz und Geräteverfügbarkeit zu verwenden. Es sollte darauf geachtet werden, dass eine optimale Laktoseentfernung gewährleistet ist. Am Tag vor dem Experiment, Samen 5 Milliliter LB Medium ergänzt mit Kanamycin und Carbenicillin aus einer frischen Bakterienkolonie mit sterilen Techniken.
Alle Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Aufregung bebrüten. Am nächsten Tag 50 Mikroliter einer Nachtkultur in fünf Milliliter frischeLB M9-Medien mit Kanamycin und Carbenicillin übertragen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlichem Schütteln, bis die Kultur eine OD600 zwischen Nullpunkt fünf und NullPunkt sieben erreicht hat.
Übertragen Sie zunächst die Nachtkulturen in einen Punkt fünf Milliliter-Röhren und Zentrifuge bei 12, 500 mal g für eine Minute. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in 500 Mikroliter1x PBS wieder auf, um eine Einzelzellsuspension vorzubereiten. Übertragen Sie die einzelzellenaufhängung in Faxröhren.
Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um GFP zu anregen und FITC-Fluoreszenzniveaus zu sammeln, wie im Textprotokoll beschrieben. Um eine Kalibrierkurve zu erstellen, machen Sie acht bis zehn Verdünnungen der Standard 2'FL im Bereich zwischen null und 2500 Milligramm pro Liter. Kultur die 2'FL Bio-Sensing-Zellen und induzieren sie mit den Standardverdünnungen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Starten Sie eine Kultur einer 2'FL produzierenden Sorte in fünf MilliliterLB-Medien und wachsen Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius an. Am nächsten Tag Subkultur bei 1% in 250 Milliliter von vorbereiteten minimalen Medien und fügen Sie Glycerin zu einer endgültigen Konzentration von 10 Gramm pro Liter. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, bis die Kultur erreicht und OD600 zwischen NullPunkt fünf und Null Punkt sieben.
Dann ipTG zu einer Endkonzentration von Null Punkt fünf Millimolar und Laktose auf eine endgültige Konzentration von zwei Gramm pro Liter hinzufügen. Bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlichem Schütteln 24 Stunden inkubieren. Übertragen Sie am nächsten Tag die Nachtkultur auf sterile 50-Milliliter-Rohre und Zentrifuge bei 900-fachem g für 15 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in entionisiertem Wasser wieder auf. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal, um Restlaktose zu entfernen. Danach das Pellet in fünf Milliliter entionisiertem Wasser wieder aufhängen.
Legen Sie die Zellen auf Eis und verwenden Sie einen Beschallungsgerät mit 30% Leistung in 30 Sekunden Impulsen, um die Zellsuspension zu lysen. Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen 25 Minuten lang mit 2 000 mal g. Entfernen Sie den Überstand und leiten Sie ihn durch einen sterilen Filter.
Bewahren Sie den gefilterten Überstand bei vier Grad Celsius auf, bis er zur Analyse bereit ist. Als nächstes impfen Sie eine Kultur von 2'FL-Bio-Sensing-Zellen. In der mittleren Logphase induzieren Sie die Zellen mit der Zelle lysieren in Konzentrationen, die denen von 2'FL entsprechen, die zur Herstellung der Kalibrierkurve verwendet werden.
Führen Sie die Kalibrierung wie im Textprotokoll beschrieben durch. Führen Sie danach die Proben auf einem Durchflusszytometer aus. Generieren Sie eine Dosis-Wirkungskurve, indem Sie die Fluoreszenzleistung mit der Oligosaccharidkonzentration vergleichen und vergleichen Sie die Reaktion der Standards mit dem Zelllysat.
Lösen Sie zunächst FL alphalysierte Betagalactosidase auf 1.000 Einheiten pro Milliliter in einem Millimolaren Magnesiumchlorid auf. Um die optimale Konzentration des benötigten Enzyms zu bestimmen, wachsen Sie ein Inokulum von 2'FL-Bio-Sensing-Zellen und in der Mid-Log-Phase mit Laktose und 2'FL induzieren. Zu 100 Mikroliterkulturen, fügen Sie variable Mengen an Beta-Galactosidase bis zu 12 Einheiten.
Lassen Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlichem Schütteln wachsen. Messen Sie die Fluoreszenz, wie im Textprotokoll beschrieben, und berechnen Sie die optimalen Einheiten des Enzyms, die durch die Bestimmung der minimalen Enzymkonzentration erforderlich sind, um die gewünschte Dämpfung des Signals zu erreichen. Zu 2'FL produzierenden Zellen, die 24 Stunden lang angebaut werden, fügen Sie die optimalen Einheiten der Beta-Galactosidase hinzu und brüten über Nacht bei 37 Grad Celsius, bestimmen Sie den 2'FL-Titer wie zuvor beschrieben.
Beginnen Sie zunächst eine 25-Milliliter-Kultur einer 2'FL produzierenden Sorte. Sobald die Sorte in der Mittleren Logphase induziert wird, bebrüten Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Als nächstes impfen Sie eine E.coli BL21-Kultur in LB-Medien.
Wachsen Sie es bis zur Mittleren Log-Phase bei 37 Grad Celsius und fügen Sie dann 15 Milliliter dieser Kultur zur 24-Stunden-Kultur 2'FL hinzu. Drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bestimmen Sie dann den 2'FL-Titer, wie zuvor beschrieben.
Beginnen Sie zunächst mit einer 25-Milliliter-Kultur einer 2'FL produzierenden Sorte. Sobald die Sorte in der Mittleren Logphase induziert wird, bebrüten Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Fügen Sie zwei Bände von 100% Ethanol in die Kultur und schütteln Sie gut.
Vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie dann die Suspension bei 900 mal g für 15 Minuten. Sammeln Sie den Überstand und brüten Über nachtbeiviert bei vier Grad Celsius, um die Laktose zu fällen.
Übergeben Sie die Lösung durch Filterpapier, um die gefällte Laktose zu entfernen. Sammeln Sie das Filtrat, das das Zelllysat enthält, und bestimmen Sie den 2'FL-Titer wie zuvor beschrieben. In dieser Studie wird eine Strategie mit hohem Durchsatz für den linkagespezifischen Nachweis von fukosylierten Humanmilcholigosacchariden verwendet.
Dies wird durch den Bau von ganzen Zellbiosensoren durch gentechnisch veränderte E.Coli erreicht, die nach Induktion mit spezifischen Glykanen mit einem fluoreszierenden Signal reagieren. Das fluoreszierende Signal unter verschiedenen Induktionsbedingungen, wie es auf einem Durchflusszytometer analysiert wird, zeigt mit dem 2'FL-Biosensor eine über 100-fache Erhöhung der Fluoreszenz im Vergleich zur Vektorsteuerung oder dem Biosensor für 3'FL. Dies zeigt die hohe Verbindungsspezifität des Biosensors.
Die Empfindlichkeit des Assays kann durch die Erzeugung einer Dosis-Wirkungskurve mit unterschiedlichen Kohlenhydratspiegeln bestimmt werden. Der dynamische lineare Erfassungsbereich von 2'FL liegt zwischen 40 und 400 Milligramm pro Liter und der Nachweisgrenzwert liegt bei vier Milligramm pro Liter. Dieser Test kann im Laufe eines Arbeitstages durchgeführt werden, wie in den Schnappschussmessungen der Dynamik des Reporterausdrucks zu sehen ist.
Die Bio-Sensing-Zellen können verwendet werden, um 2'FL aus einem konstruierten 2'FL-Produzentenstamm zu erkennen und zu quantifizieren, indem eine Reihe von Strategien verwendet werden, um das Signal aus exogener Laktose zu reduzieren, so dass das ausgelesene Signal direkt der 2'FL-Konzentration entsprechen würde. Eine Strategie ist es, die Laktose mit einer Beta-Galactosidase, die nicht auf modifizierte Laktose wirkt, enzymatisch zu degradieren. Eine weitere Strategie nutzte Ethanol, das nicht nur selektiv Lactose ausfällt, sondern auch die Erzeugerzellen limt, da die Zelllyse ein notwendiger Schritt nach unten ist.
Schließlich ist die effektivste, aber zeitaufwändigste Methode, die Zellen vor der Zelllyse zu pellet und zu waschen, um die intrazelluläre 2'FL freizusetzen. Sobald wir diese Methode etabliert haben, konnten wir das Repertoire an Oligosaccharid-Targets mit verschiedenen Enzymen erweitern. Derzeit können wir neun verschiedene Oligosaccharide erkennen und wir arbeiten an mehr.
Bei der Optimierung dieses Assays bemerkten wir die Robustheit unserer Enzyme, die es uns ermöglichte, eine Technik zu erarbeiten, die eine Verknüpfungsspezifische sende in etwa fünf Minuten ausliest. Obwohl keines der hier verwendeten Reagenzien besonders gefährlich ist, sollten diejenigen, die diese Methode anwenden, die üblichen Biogefährdungs- und Biocontainment-Verfahren einschließlich des Tragens ordnungsgemäßer PSA befolgen.
