이 방법은 인간 우유 올리고당류의 생산에 관련된 몇 가지 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 첫째, 얼마나 많은 제품을 가지고 있습니까? 둘째, 특정 탄수화물 연결은 무엇입니까?
여기서 목표는 이러한 인간 우유 올리고당류를 정량화하고 특성화하는 과정을 단순화하고 가속화하는 것입니다. 이 방법은 현재 기술의 상태에 비해 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 높은 처리량 스크리닝에 대한 의무입니다.
그래서, 당신은 이 기술을 사용하여 하루에 다른 조건 또는 어쩌면 합성 효소의 라이브러리의 수천을 테스트 상상할 수 있습니다. 또한, 자연이 효소에서 진화한 독특한 기판 특이성을 사용하여 이러한 올리고당류의 탄수화물 연계에 대한 정보를 제공합니다. 우리는 이 방법이 인간 우유 올리고당류의 생산을 향상시킬 수 있다고 믿으며, 이는 인간 모유를 더 가깝게 모방하고 모유를 먹이고 모유를 먹는 아기 사이의 격차를 해소하는 데 도움이 되는 더 나은 품질의 유아 분유로 이어질 수 있다고 믿습니다.
비용, 처리량 및 장비 가용성에 따라 유당 제거에 사용할 방법을 결정할 때 사용자 재량에 따라 사용하는 것이 좋습니다. 최적의 유당 제거를 보장하기 위해 주의해야 합니다. 실험 전날, 멸균 기술을 사용하여 신선한 세균 식민지에서 카나마이신과 카베니실린으로 보충된 LB 배지의 5 밀리리터를 시드.
동요와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 모든 문화를 배양. 다음 날, 카나마이신과 카베니실린과 신선한 LB M9 미디어의 다섯 밀리리터로 하룻밤 문화의 50 마이크로 리터를 전송합니다. 문화가 0 포인트 5와 0 점 7 사이에 OD600에 도달 할 때까지 연속 흔들림과 섭씨 37도에서 배양.
먼저, 하룻밤 문화를 1포인트 5 밀리리터 튜브와 원심분리기로 1분 동안 12, 500회 g로 옮긴다. 1x PBS의 500 마이크로리터에서 상체를 버리고 펠릿을 다시 일시 중단하여 단일 셀 서스펜션을 준비합니다. 단일 셀 서스펜션을 팩스 튜브로 전송합니다.
흐름 사이토미터를 사용하여 GFP를 자극하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 FITC 형광 수준을 수집합니다. 보정 곡선을 만들려면 리터당 0~2500밀리그램 의 범위에서 표준 2'FL의 8~10희석제를 만듭니다. 2'FL 바이오 센싱 세포를 배양하고 텍스트 프로토콜에 설명된 표준 희석제로 유도합니다.
LB 미디어의 5 밀리리터에서 균주를 생산하는 2'FL의 문화를 시작하고 섭씨 37도에서 하룻밤 을 성장. 다음 날, 서브 컬쳐에서 1%에 250 제조 된 최소 미디어의 밀리 리터와 글리세롤의 최종 농도에 글리세롤을 추가 10 리터 당 그램. 문화가 도달할 때까지 섭씨 37도에서 배양하고 0포인트 5와 0점 7 사이에 OD600을 배양합니다.
그런 다음 IPTG를 0점 5 밀리몰러와 유당의 최종 농도에 추가하여 리터당 2그램의 최종 농도를 가집니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 연속 흔들림을 가합니다. 다음 날, 15 분 동안 900 배 g에서 50 밀리리터 튜브와 원심 분리기를 멸균하기 위해 하룻밤 문화를 옮긴다.
상체를 버리고 탈화 된 물에 펠릿을 다시 중단하십시오. 잔류 유당을 제거하기 위해 이 세척을 세 번 반복하십시오. 그 후, 탈이온화된 물의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.
세포를 얼음 위에 놓고 30초 펄스에서 30%의 전력으로 초음파 처리기를 사용하여 세포 현탁액을 용인합니다. 25 분 동안 2, 000 배 g에서 lysed 세포를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 멸균 필터를 통과합니다.
분석할 준비가 될 때까지 여과된 상체를 섭씨 4도에 저장합니다. 다음으로, 2'FL 바이오 센싱 셀의 배양을 접종한다. 중간 로그 단계에서, 교정 곡선을 만드는 데 사용되는 2'FL의 농도에 해당하는 농도로 세포 용액을 가진 세포를 유도한다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 교정을 수행합니다. 그런 다음 유동 사이토미터에서 샘플을 실행합니다. 올리고당 농도에 대한 형광 출력을 플로팅하여 투여량 반응 곡선을 생성하고 표준의 반응을 세포 리스에 비교한다.
먼저, FL 알파분해 베타 갈라콘토시다아제1밀리머 마그네슘염화마그네슘에 밀리리터당 1, 000단위로 용해한다. 필요한 효소의 최적의 농도를 결정하기 위해 2'FL 바이오 센싱 셀의 접종을 성장시키고 중간 로그 단계에서 유당 및 2'FL로 유도하십시오. 100 마이크로리터 배양에 최대 12 단위의 베타 갈라토시다아제의 가변 양을 추가합니다.
문화가 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 자라도록 합시다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 형광을 측정하고 신호의 원하는 감쇠를 달성하기 위해 최소 효소 농도를 결정함으로써 필요한 효소의 최적 단위를 계산한다. 24시간 동안 자란 2'FL 생산 세포에 베타 갈라토시다아제의 최적 단위를 추가하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고, 이전에 설명한 대로 2'FL 티터를 결정한다.
첫째, 2'FL 생산 균주의 25 밀리리터 문화를 시작합니다. 중간 로그 단계에서 균주가 유도되면 24시간 동안 37°C에서 배양합니다. 다음으로, LB 미디어에서 대장균 BL21 문화를 접종합니다.
섭씨 37도에서 중간 로그 단계로 성장한 다음 24시간 2'FL 문화에 이 문화의 15밀리리터를 추가합니다. 3시간 동안 섭씨 37도에서 배양하세요. 그런 다음, 앞에서 설명한 대로 2'FL 티트르를 결정합니다.
시작하려면 2'FL 생산 변형의 25 밀리리터 문화를 시작합니다. 중간 로그 단계에서 균주가 유도되면 24시간 동안 37°C에서 배양합니다. 문화에 100% 에탄올의 두 볼륨을 추가하고 잘 흔들어.
섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하세요. 그런 다음 서스펜션을 900배 g에서 15분간 원심분리합니다. 상체를 수집하고 유당을 침전하기 위해 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
침전유를 제거하기 위해 필터 용지를 통해 용액을 전달합니다. 세포 리스를 포함하는 여과를 수집하고 이전에 설명한 대로 2'FL 티트르를 결정합니다. 이 연구에서는, 고처리량 전략은 fucosylated 인간 우유 올리고당류의 연결 특정 검출을 위해 이용됩니다.
이것은 특정 글리칸으로 유도시 형광 신호로 반응하는 유전자 공학 E.Coli에 의해 전세포 바이오 센서를 구축함으로써 달성됩니다. 유동 세포계상에서 분석된 바와 같이 다양한 유도 조건 하에서 형광 신호는 벡터 전용 제어 또는 3'FL용 바이오 센서에 비해 2'FL 바이오 센서를 사용하여 형광이 100배 이상 증가하는 것을 나타낸다. 이는 바이오 센서의 높은 연결 특이성을 보여줍니다.
분석의 감도는 다양한 탄수화물 수준으로 용량 반응 곡선을 생성하여 결정될 수 있다. 2'FL 검출의 동적 선형 범위는 리터당 40~400밀리그램으로 보이며 검출 한계는 리터당 4밀리그램입니다. 이 분석은 리포터 표현의 역학의 스냅 샷 측정에서 볼 수 있듯이 근무일의 과정을 통해 수행 될 수있다.
바이오 센싱 셀은 2'FL 농도에 직접 대응할 수 있도록 외인성 유당으로부터의 신호를 줄이기 위한 여러 전략을 사용하여 엔지니어링된 2'FL 생산자 균주에서 2'FL을 검출하고 정량화하는 데 사용할 수 있다. 한 가지 전략은 수정된 유당에 작용하지 않는 베타 갈라토시다이를 사용하여 유당을 효소적으로 저하시키는 것입니다. 또 다른 전략은 유당을 선택적으로 침전시킬 뿐만 아니라 세포 리시스가 필요한 단계 다운 스트림이기 때문에 생산자 세포를 리스하는 에탄올을 활용하였다.
마지막으로, 가장 효과적이지만 시간이 많이 걸리는 방법은 세포 내 2'FL을 방출하기 위해 세포 리시스 이전에 세포를 펠릿과 세척하는 것입니다. 일단 우리가 이 방법을 확립하면, 우리는 다른 효소를 사용하여 올리고당 표적의 레퍼토리를 확장할 수 있었습니다. 현재, 우리는 아홉 가지 올리고당을 감지 할 수 있으며 더 많은 작업을 하고 있습니다.
이 분석법을 최적화하는 동안, 우리는 우리의 효소의 견고성이 우리가 약 5 분 안에 연결 특정 읽기를 제공하는 기술을 마련할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 여기에 사용되는 시약중 어느 것도 특히 위험하지않지만,이 방법을 사용하는 사람들은 적절한 PPE착용을 포함하여 표준 생체 위험 및 생체 함유 절차를 따라야합니다.
