Este protocolo es significativo porque este es un método eficiente para el aislamiento del tejido ocular pupal Drosophila para múltiples aplicaciones aguas abajo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la rápida disección de un gran número de ojos pupales sin dañar el tejido. La disección de la retina pupal Drosophila será un reto para los principiantes.
Practicar la técnica es la mejor manera de mejorar la velocidad de las disecciones y la calidad de los resultados. Después de colocar las pupas Drosophila en un plato de disección negro, coloque un pedazo fresco de cinta adhesiva de doble cara en el plato diseccionador, lejos de las pupas, y use un par de fórceps para colocar cuidadosamente el lado dorsal pupae hacia arriba en la cinta. Coloque el plato debajo de un microscopio estéreo y use fórceps para eliminar el opérculo de cada pupa.
Utilice tijeras de microdisección para cortar cada caso de pupal, lo que permite que se abra la cabeza, el tórax y el segmento abdominal anterior, y asegure los bordes de la caja pupal a la cinta de doble cara. Perfora el abdomen de cada pupa con fórceps afilados, y retira la pupa de su estuche pupal. Coloque la pupa en el plato de disección, lejos de la cinta, y cubra la pupa con 400 microlitros de PBS helado.
Use fórceps para agarrar cada uno por el abdomen, y use las tijeras de microdisección para hacer una incisión transversal limpia a través del tórax, cortando las pupas por la mitad. Usando dos pares de fórceps finos, agarre los bordes cortados de cada epítelio del tórax y desgarre gradualmente el tórax y la cápsula de la cabeza, exponiendo el complejo ojo-cerebro y el tejido graso circundante. Luego, sin agarrar el tejido, usa fórceps para guiar cada complejo ojo-cerebro translúcido, blanquecino y en forma de mancuerna, lejos de los restos de la cápsula de la cabeza.
Después de diseccionar de seis a 10 pupas, corta una punta de micropipeta con una cuchilla de afeitar limpia a un diámetro de aproximadamente un milímetro, y lubrica la punta con una mezcla de PBS y grasa. Utilice la punta de la pipeta lubricada para transferir los complejos ojo-cerebro a un pozo de un plato de vidrio de nueve pocús que contiene 400 microlitros de PBS sobre hielo, y luego transfiera el tejido en 20 microlitros de PBS en al menos 250 microlitros de fijador para una incubación de 35 minutos en hielo. Al final de la fijación, utilice la misma punta de pipeta para transferir el tejido a un tercer pozo que contenga 400 microlitros de PBS fresco durante cinco a 10 minutos en hielo.
Para bloquear cualquier unión de anticuerpos no específica, transfiera los complejos ojo-cerebro a 400 microlitros de PBS más Triton X para una incubación de 10 a 60 minutos sobre hielo. Al final de la incubación, aliquot 10 microlitros de la solución de anticuerpos primarios en el número necesario de pozos de una placa de micropocillos de 72 pocillos, y utilizar una micropipeta de desplazamiento de aire P10 con una punta modificada de 0,5 milímetros lubricada con PBS más Triton X para transferir no más de cinco complejos cerebrales oculares y no más de tres microlitros de PBS en cada pozo de solución de anticuerpos. Después de una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados, lave las muestras dos veces en 400 microlitros de PBS más Triton X en un pozo de un plato de vidrio de nueve pogulos durante cinco a 10 minutos por lavado.
Después del tercer lavado, transfiera el tejido a 100 microlitros de una solución de anticuerpos secundaria apropiada durante dos horas a temperatura ambiente, protegida de la luz, siguiendo tres lavados de cinco a 10 minutos en 400 microlitros de PBS más Triton X y un lavado en PBS. A continuación, equilibre las muestras en 200 microlitros de medio de montaje durante una o dos horas. Al final de la incubación, transfiera las muestras a un portaobjetos del microscopio y use una aguja de tungsteno resistente para fijar un complejo ojo-cerebro a la diapositiva bajo un microscopio diseccionado.
Luego, usa una aguja fina de tungsteno para cortar cada ojo lejos de su lóbulo óptico asociado y maniobrar cada ojo a la superficie del portaobjetos del microscopio de modo que la superficie basal del ojo esté adyacente a la diapositiva. A continuación, aplique un cubreobjetos limpio sobre las muestras y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Para preparar el tejido ocular pupal para el análisis de manchas occidentales, primero diseccione 10 a 16 pupas como se demostró anteriormente en dos lotes, 10 a 15 minutos de diferencia en PBS complementado con inhibidores de la proteasa y fosfatasa.
Después de enjuagar brevemente los complejos ocular-cerebro aislados dos veces en pozos individuales de un plato de vidrio de nueve pozos en hielo en 400 microlitros de PBS más inhibidores, transfiera todos los complejos ojo-cerebro en 400 microlitros de PBS helados más inhibidores decantados en un plato de disección negro limpio. Bajo un microscopio diseccionador limpio, usa una aguja de tungsteno resistente y una cuchilla de afeitar fina para cortar limpiamente cada ojo del lóbulo óptico, y usa una punta lubricada para transferir los complejos ojo-cerebro en cinco microlitros de PBS más inhibidores en un tubo de microcentrífuga de 500 microlitros sobre hielo. A continuación, agregue cinco microlitros de tampón de lisis de tejido occidental y 10 microlitros de tampón de muestra de proteína concentrada 2X al tubo.
Para procesar los complejos ojo-cerebro para la extracción de ARN, usar guantes, limpiar la sobremesa, el microscopio, las herramientas de disección y los platos de disección negra con un reactivo de descontaminación de etanol y ARNA. Después de permitir que el área se seque, disecciona un total de 30 a 40 pupas en lotes de seis a ocho. Después de que cada lote de complejos ojo-cerebro se han diseccionado, transferir los complejos ojo-cerebro de la placa de nueve pozos en 400 microlitros de PBS fresco, helado, libre de nucasas en un plato de disección limpia, y utilizar una aguja de tungsteno resistente y una hoja de afeitar fina para cortar limpiamente cada ojo del lóbulo óptico.
Cuando se hayan eliminado todos los ojos de un lote, transfiéralos a un tubo de microcentrífuga estéril sin RNase y congela las muestras en nitrógeno líquido antes de pasar al siguiente lote. El ojo pupal es un tejido de fácil acceso que sirve como un excelente modelo para investigar los procesos de desarrollo, incluyendo aquellos que impulsan la morfogénesis. Alrededor de 40 horas después de la formación del puparium, se logra la disposición final de las células.
Esta es una edad ideal para evaluar las consecuencias de una mutación genética o expresión génica modificada. Por ejemplo, después de la expresión ectópica de Diap1, un inhibidor central de la apoptosis, el consiguiente aumento en el número de células de celosía se puede comparar con el observado en una retina de control. La apoptosis también se puede evaluar más directamente mediante la utilización de anticuerpos para activar una caspasa de la muerte-1 o mediante el uso de otros enfoques para detectar células moribundas.
Los análisis de manchas occidentales de los litos oculares se pueden utilizar para determinar la presencia o expresión relativa de proteínas de interés o para comparar la expresión de proteínas en diferentes puntos de tiempo de desarrollo. Es importante tener en cuenta que diseccionar más de 60 ojos por genotipo o condición experimental es óptimo para aislar suficiente ARN de alta calidad. Lo más importante a recordar es que la retina pupal es extremadamente frágil, y se debe tener mucho cuidado durante su disección para asegurar su integridad.
