これは、複数の下流アプリケーションのためのショウジョウバエプパル眼組織の単離のための効率的な方法であるため、このプロトコルは重要です。この技術の主な利点は、組織を損傷することなく、多数のプパルの目の迅速な解剖を可能にすることです。ショウジョウバエのプパルレティナの解剖は初心者にとって挑戦的です。
このテクニックを練習することは、分節の速度と結果の質を向上させる最良の方法です。ショウジョウバエの子犬を黒い解剖皿に置いた後、子犬から離れて解剖皿に両面テープの新鮮な部分を置き、慎重にテープの上に子犬のドールサル側を置くために鉗子のペアを使用しています。皿をステレオ顕微鏡の下に置き、鉗子を使って各子犬のオペルキュラムを取り除きます。
マイクロディセクションはさみを使用して各パパルケースをスライスし、頭、胸郭、および前腹部セグメントを明らかにするために開いて羽ばたきさせ、パパルケースの端を両面テープに固定します。鋭利な鉗子で各子犬の腹部を突き刺し、その子犬の場合から子犬を取り除きます。テープから離れて解剖皿の上に子犬を置き、氷冷PBSの400マイクロリットルで子犬を覆います。
鉗子を使って腹部でそれぞれをつかみ、マイクロディセクションはさみを使って胸郭を通して1つのきれいな断面切開を行い、子犬を半分に切ります。2組の細かい鉗子を用いて、各胸郭上皮の切り取り端をつかみ、胸郭と頭部カプセルを徐々に引き裂き、眼と脳複合体および周囲の脂肪組織を露出させる。そして、組織を把握することなく、鉗子を使用して、ヘッドカプセルの残骸から離れて、各半透明、オフホワイト、ダンベル型の眼脳複合体を導く。
6~10匹の子犬を解剖した後、きれいなカミソリの刃でマイクロピペットの先端を直径約1ミリメートルに切り、PBSと脂肪の混合物で先端を潤滑する。潤滑ピペットチップを使用して、氷上のPBSの400マイクロリットルを含む9ウェルガラス皿の1つの井戸に眼脳複合体を移し、PBSの20マイクロリットルで組織を少なくとも250マイクロリットルの固定化に移し、氷上で35分間インキュベーションします。固定の終わりに、同じピペットチップを使用して、氷の上で5〜10分間、新鮮なPBSの400マイクロリットルを含む第3の井戸に組織を移します。
非特異的抗体結合を遮断するには、目の脳複合体を400マイクロリットルのPBSとトリトンXに移し、氷の上で10〜60分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、アリコート10マイクロリットルの一次抗体溶液を72ウェルマイクロウェルプレートの必要な数のウェルに入れ、PBSとトリトンXで潤滑された修正0.5ミリメートルの先端を備えたP10空気変位マイクロピペットを使用して、5マイクロ脳複合体以下を伝達し、各各抗体ウェルにPBSの3マイクロリットル以下を移動させる。摂氏4度で一晩インキュベーションした後、PBSとトリトンXの400マイクロリットルでサンプルを9ウェルガラス皿の1ウェルで2回洗浄し、1回5〜10分間洗浄します。
3回目の洗浄後、PBSとトリトンXの400マイクロリットルとPBSで1回の洗浄を行い、光から保護された2時間、適切な二次抗体溶液の100マイクロリットルに組織を移します。次いで、200マイクロリットルの取り付け媒体のサンプルを1〜2時間平衡化する。インキュベーションの最後に、サンプルを顕微鏡スライドに移し、頑丈なタングステン針を使用して、眼科複合体を解剖顕微鏡下でスライドにピン留めします。
次に、細かいタングステン針を使用して、関連する視頭葉から各目を切り離し、眼の基底面がスライドに隣接するように、各眼を顕微鏡スライドの表面まで操縦させる。その後、サンプルの上にきれいなカバースリップを適用し、マニキュアでカバースリップを密封します。ウエスタンブロット分析のためにプパル眼組織を調製するために、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加したPBSで10〜15分離れた2つのバッチで既に実証したように、最初に10〜16匹の子犬を解剖する。
PBSと阻害剤の400マイクロリットルの氷上の9ウェルガラス皿の個々の井戸で孤立した眼脳複合体を2回洗い上げた後、目脳複合体のすべてを400マイクロリットルの氷冷PBSと清潔な黒解剖皿にデカン化された阻害剤に移します。きれいな解剖顕微鏡の下で、頑丈なタングステン針と細かいカミソリの刃を使用して光学ローブから各目をきれいに切断し、潤滑された先端をPBSと阻害剤の5マイクロリットルに5マイクロリットルに移し、氷の上の500マイクロセントリフュージチューブに移します。次いで、5マイクロリットルの西洋組織のライシスバッファーと2X濃縮タンパク質サンプルバッファーの10マイクロリットルをチューブに加えます。
RNA抽出のための眼脳複合体を処理するために、手袋を着用し、ベンチトップ、顕微鏡、解剖ツール、および70%エタノールおよびRNase除染試薬で食器を洗い流す黒い解剖を行う。乾燥させた後、合計30~40匹の子犬を6~8匹のバッチで解剖する。目と脳の複合体の各バッチが解剖された後、9ウェル皿から目脳複合体をきれいな解剖皿の新鮮な氷冷、ヌクレアーゼフリーPBSの400マイクロリットルに移し、頑丈なタングステン針と細かいカミソリの刃を使用して、光学ロベから各目をきれいに切断します。
バッチのすべての目が取り除かれたら、それらを無菌、RNaseフリーのマイクロ遠心分離管に移し、次のバッチに進む前に液体窒素でサンプルをフラッシュフリーズします。パパルアイは、形態形成を促進するものを含む発達過程を調査するための優れたモデルとして役立つ容易にアクセス可能な組織です。約40時間後に、子犬の形成は、細胞の最終的な配置が達成される。
これは、遺伝子変異または改変遺伝子発現の結果を評価するのに理想的な年齢です。例えば、アポトーシスのコア阻害剤であるDiap1の異所性発現後、その結果、格子細胞数の増加は、対照性筋で観察されたものと比較することができる。アポトーシスは、死のカスパーゼ-1を活性化する抗体を利用するか、死にかけている細胞を検出するための他のアプローチを使用することによって、より直接的に評価することもできる。
目のライセートのウェスタンブロット分析は、関心のあるタンパク質の存在または相対発現を決定したり、異なる発達時におけるタンパク質発現を比較するために使用することができる。十分な高品質のRNAを単離するのに最適な遺伝子型や実験条件ごとに60以上の目を解剖することは重要です。覚えておかなければならない最も重要なことは、プパルのretinaは非常に壊れやすい、と細心の注意は、その完全性を確保するために、その解剖の間に取られなければならないということです。
