Dieses Protokoll ist wichtig, da dies eine effiziente Methode zur Isolierung von Drosophila Pupal Augengewebe für mehrere nachgeschaltete Anwendungen ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es die schnelle Zerlegung einer großen Anzahl von Pupalaugen ermöglicht, ohne das Gewebe zu beschädigen. Die Zerlegung der Drosophila Pupal Netzhaut wird für Anfänger eine Herausforderung sein.
Das Üben der Technik ist der beste Weg, um die Geschwindigkeit der Sezierungen und die Qualität der Ergebnisse zu verbessern. Nachdem Sie die Drosophila-Pupae auf eine schwarze Sezschale gelegt haben, legen Sie ein frisches Stück doppelseitiges Klebeband auf das Trenngericht, weg von der Pupae, und verwenden Sie ein Paar Zangen, um die dorsale Seite der Welpen vorsichtig auf das Band zu legen. Legen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie Zangen, um das Operculum jeder Pupa zu entfernen.
Verwenden Sie Mikrodissektionsscheren, um jedes Pupalgehäuse zu schneiden, so dass es geöffnet werden kann, um den Kopf, Thorax und das vordere Bauchsegment zu offenbaren, und die Ränder des Pupalgehäuses auf dem doppelseitigen Band zu sichern. Pierce den Bauch jeder Pupa mit scharfen Zangen, und entfernen Sie die Pupa aus seinem Pupal-Gehäuse. Legen Sie die Pupa auf die Sezierschale, weg vom Band, und bedecken Sie die Pupa mit 400 Mikrolitere eiskaltes PBS.
Verwenden Sie Zangen, um jeden einzelnen durch den Bauch zu greifen, und verwenden Sie die Mikrodissektionsschere, um einen sauberen Querschnittsschnitt durch den Thorax zu machen, wobei die Pupas halbiert werden. Greifen Sie mit zwei Paaren feiner Zangen die Schnittkanten jedes Thoraxepithels und reißen Sie nach und nach die Thorax- und Kopfkapsel auf, wodurch der Augen-Hirn-Komplex und das umgebende Fettgewebe freigelegt werden. Dann, ohne das Gewebe zu greifen, verwenden Sie Zangen, um jeden durchscheinenden, nicht-weißen, hantelförmigen Augen-Hirn-Komplex weg von den Resten der Kopfkapsel zu führen.
Nach der Zersebung von sechs bis zehn Welpen eine Mikropipettespitze mit einer sauberen Rasierklinge auf einen Durchmesser von etwa einem Millimeter schneiden und die Spitze mit einer Mischung aus PBS und Fett schmieren. Verwenden Sie die geschmierte Pipettenspitze, um die Augen-Hirn-Komplexe in einen Brunnen einer Neun-Well-Glasschale mit 400 Mikroliter PBS auf Eis zu übertragen, und übertragen Sie dann das Gewebe in 20 Mikroliter PBS in mindestens 250 Mikroliter Fixativ für eine 35-minütige Inkubation auf Eis. Am Ende der Fixierung verwenden Sie die gleiche Pipettenspitze, um das Gewebe in einen dritten Brunnen zu übertragen, der 400 Mikroliter frische sestelle PBS für fünf bis zehn Minuten auf Eis enthält.
Um eine unspezifische Antikörperbindung zu blockieren, übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe in 400 Mikroliter PBS plus Triton X für eine 10- bis 60-minütige Inkubation auf Eis. Am Ende der Inkubation, aliquot 10 Mikroliter der primären Antikörperlösung in die notwendige Anzahl von Brunnen einer 72-Well-Mikrowell-Platte, und verwenden Sie eine P10 Luftverschiebung Mikropipette mit einer modifizierten 0,5-Millimeter-Spitze mit PBS plus Triton X geschmiert, um nicht mehr als fünf Augen-Gehirn-Komplexe und nicht mehr als drei Mikroliter PBS in jeden Brunnen der Antikörperlösung zu übertragen. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius die Proben zweimal in 400 Mikroliter PBS plus Triton X in einem Brunnen einer Neun-Well-Glasschale für fünf bis zehn Minuten pro Wäsche waschen.
Nach der dritten Wäsche das Gewebe für zwei Stunden bei Raumtemperatur in 100 Mikroliter einer geeigneten Sekundärantikörperlösung übertragen, die vor Licht geschützt ist, gefolgt von drei fünf- bis zehnminütigen Wäbungen in 400 Mikroliter PBS plus Triton X und einer Wäsche in PBS. Anschließend die Proben in 200 Mikroliter Njekmittel für ein bis zwei Stunden ausdemieren. Übertragen Sie die Proben am Ende der Inkubation auf ein Mikroskopschlitten und heften Sie mit einer stabilen Wolframnadel einen Augen-Hirn-Komplex unter einem Sezierendes Mikroskop an das Dia an.
Dann verwenden Sie eine feine Wolframnadel, um jedes Auge von seinem zugehörigen optischen Lappen weg zu schneiden und jedes Auge auf die Oberfläche des Mikroskopschlittens zu manövrieren, so dass die Basaloberfläche des Auges neben dem Dia liegt. Dann einen sauberen Deckelschlupf über die Proben auftragen und den Deckelrutsch mit Nagellack versiegeln. Um Pupal-Augengewebe für die Western-Blot-Analyse vorzubereiten, sezieren Sie zuerst 10 bis 16 Pupilben, wie zuvor in zwei Chargen nachgewiesen, 10 bis 15 Minuten auseinander in PBS, ergänzt mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren.
Nachdem die isolierten Augen-Hirn-Komplexe zweimal in einzelnen Brunnen einer Neun-Well-Glasschale auf Eis in 400 Mikroliter PBS plus Inhibitoren kurz abspült wurden, übertragen Sie alle Augen-Hirn-Komplexe in 400 Mikroliter eiskalteS PBS plus dedekanierte Inhibitoren auf eine saubere schwarze Sezierende Schale. Verwenden Sie unter einem sauberen Sezieren des Mikroskops eine robuste Wolframnadel und eine feine Rasierklinge, um jedes Auge sauber aus dem optischen Lappen zu schneiden, und verwenden Sie eine geschmierte Spitze, um die Augen-Hirn-Komplexe in fünf Mikroliter PBS plus Inhibitoren in ein 500-Mikroliter-Mikrozentrifugenrohr auf Eis zu übertragen. Fügen Sie dann fünf Mikroliter westlichen Gewebelysepuffers und 10 Mikroliter 2X konzentrierten Proteinprobenpuffer in die Röhre.
Um die Augen-Hirn-Komplexe für die RNA-Extraktion zu verarbeiten, Handschuhe zu tragen, die Tischplatte, das Mikroskop, Sezieren von Werkzeugen und schwarze Seziergeschirre mit 70% Ethanol und RNase-Dekontaminationsreagenz zu reinigen. Nachdem Sie die Fläche trocknen lassen, sezieren Sie insgesamt 30 bis 40 Welpen in Chargen von sechs bis acht. Nachdem jede Charge von Augen-Hirn-Komplexen seziert wurden, übertragen Sie die Augen-Hirn-Komplexe aus der Neun-Well-Schale in 400 Mikroliter frischen, eiskalten, nukleasefreien PBS auf einer sauberen Sezierenschale, und verwenden Sie eine robuste Wolframnadel und eine feine Rasierklinge, um jedes Auge sauber aus dem optischen Lappen zu schneiden.
Wenn alle Augen für eine Charge entfernt wurden, übertragen Sie sie in ein steriles, RNase-freies Mikrozentrifugenrohr und blitzen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein, bevor Sie zur nächsten Charge übergehen. Das Pupalauge ist ein leicht zugängliches Gewebe, das als ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen dient, einschließlich derjenigen, die die Morphogenese vorantreiben. Etwa 40 Stunden nach der Pupariumbildung ist die endgültige Anordnung der Zellen erreicht.
Dies ist ein ideales Alter, um die Folgen einer genetischen Mutation oder einer modifizierten Genexpression zu beurteilen. Zum Beispiel, nach der ektopischen Expression von Diap1, einem Kerninhibitor der Apoptose, kann die daraus resultierende Erhöhung der Anzahl der Gitterzellen mit der in einer Kontrollnetzhaut beobachteten verglichen werden. Apoptose kann auch direkter beurteilt werden, indem Antikörper verwendet werden, um eine Todeskaspase-1 zu aktivieren, oder indem andere Ansätze zum Nachweis sterbender Zellen verwendet werden.
Western Blot Analysen von Augenlysaten können verwendet werden, um das Vorhandensein oder die relative Expression von Proteinen von Interesse zu bestimmen oder um die Proteinexpression zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten zu vergleichen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Sezieren von mehr als 60 Augen pro Genotyp oder experimentellen Zustand ist optimal für die Isolierung ausreichend hochwertige RNA. Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, dass die Pupal-Retina extrem zerbrechlich ist, und während ihrer Zerlegung muss sehr vorsichtig sein, um ihre Integrität zu gewährleisten.
