Este protocolo é significativo porque este é um método eficiente para o isolamento do tecido ocular pupal Drosophila para múltiplas aplicações a jusante. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a dissecação rápida de um grande número de olhos pupais sem danificar o tecido. A dissecação da retina pupal Drosophila será um desafio para os novatos.
Praticar a técnica é a melhor maneira de melhorar a velocidade das dissecções e a qualidade dos resultados. Depois de colocar o pupae Drosophila em um prato de dissecação preto, coloque um pedaço fresco de fita dupla face no prato de dissecação, longe da pupae, e use um par de fórceps para colocar cuidadosamente o lado dorsal pupae sobre a fita. Coloque o prato sob um microscópio estéreo e use fórceps para remover o operculum de cada pupa.
Use uma tesoura de microdisseção para cortar cada caixa pupal, permitindo que ela seja aberta para revelar a cabeça, o tórax e o segmento abdominal anterior, e fixar as bordas da caixa pupal à fita de dupla face. Fure o abdômen de cada pupa com fórceps afiados, e remova a pupa de sua caixa pupal. Coloque a pupa no prato de dissecção, longe da fita, e cubra a pupa com 400 microliters de PBS gelado.
Use fórceps para agarrar cada um pelo abdômen, e use a tesoura de microdisseção para fazer uma incisão transversal limpa através do tórax, cortando a pupa ao meio. Usando dois pares de fórceps finos, segure as bordas cortadas de cada epitélio tórax e gradualmente rasgue o tórax e a cápsula da cabeça, expondo o complexo olho-cérebro e o tecido adiposo circundante. Então, sem agarrar o tecido, use fórceps para guiar cada complexo translúcido, off-white, em forma de haltere, em forma de haltere, longe dos restos da cápsula da cabeça.
Depois de dissecar de 6 a 10 pupas, corte uma ponta de micropipette com uma lâmina de barbear limpa a um diâmetro de cerca de um milímetro, e lubrifique a ponta com uma mistura de PBS e gordura. Use a ponta de pipeta lubrificada para transferir os complexos olho-cérebro para um poço de um prato de vidro de nove poços contendo 400 microliters de PBS no gelo, e, em seguida, transferir o tecido em 20 microliters de PBS em pelo menos 250 microliters de fixação para uma incubação de 35 minutos no gelo. No final da fixação, use a mesma ponta de pipeta para transferir o tecido para um terceiro poço contendo 400 microliters de PBS frescos por cinco a 10 minutos no gelo.
Para bloquear qualquer ligação de anticorpos não específico, transfira os complexos olho-cérebro em 400 microliters de PBS mais Triton X para uma incubação de 10 a 60 minutos no gelo. Ao final da incubação, aliquot 10 microliters da solução de anticorpos primários no número necessário de poços de uma placa de microwell de 72 poços, e usar uma micropipette de deslocamento de ar P10 com uma ponta modificada de 0,5 milímetros lubrificada com PBS mais Triton X para transferir não mais do que cinco complexos cerebrais oculares e não mais do que três microliters de PBS em cada poço de solução de anticorpos. Depois de uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius, lave as amostras duas vezes em 400 microliters de PBS mais Triton X em um poço de um prato de vidro de nove poços por cinco a 10 minutos por lavagem.
Após a terceira lavagem, transfira o tecido para 100 microliters de uma solução de anticorpos secundários apropriada por duas horas à temperatura ambiente, protegido da luz, seguindo por três lavagens de cinco a 10 minutos em 400 microliters de PBS mais Triton X e uma lavagem em PBS. Em seguida, equilibre as amostras em 200 microliters de meio de montagem por uma a duas horas. No final da incubação, transfira as amostras para um slide de microscópio, e use uma agulha de tungstênio resistente para fixar um complexo olho-cérebro ao slide sob um microscópio dissecando.
Em seguida, use uma agulha de tungstênio fina para cortar cada olho de seu lobo óptico associado e para manobrar cada olho para a superfície do microscópio deslizar para que a superfície basal do olho seja adjacente ao slide. Em seguida, aplique uma mancha de cobertura limpa sobre as amostras e sele a mancha com esmalte. Para preparar o tecido ocular pupal para a análise da mancha ocidental, primeiro disseco de 10 a 16 pupas como demonstrado anteriormente em dois lotes, de 10 a 15 minutos de diferença em PBS complementado com inibidores de protease e fosfatase.
Depois de enxaguar brevemente os complexos olho-cérebro isolados duas vezes em poços individuais de um prato de vidro de nove poços no gelo em 400 microliters de PBS mais inibidores, transfira todos os complexos olho-cérebro em 400 microliters de PBS gelado mais inibidores decantados em um prato de dissecação preto limpo. Sob um microscópio de dissecação limpa, use uma agulha de tungstênio resistente e uma lâmina de barbear fina para cortar cada olho do lobo óptico, e use uma ponta lubrificada para transferir os complexos olho-cérebro em cinco microlitros de PBS mais inibidores em um tubo de microcentrífusão de 500 microlitros no gelo. Em seguida, adicione cinco microliters de tampão de tecido ocidental e 10 microliters de tampão de amostra de proteína concentrada 2X ao tubo.
Para processar os complexos olho-cérebro para extração de RNA, usando luvas, limpar o bancada, microscópio, ferramentas de dissecação e pratos de dissecação preto com 70% de etanol e reagente de descontaminação RNase. Depois de permitir que a área seque, disseque um total de 30 a 40 pupas em lotes de seis a oito. Depois que cada lote de complexos olho-cérebro foram dissecados, transfira os complexos olho-cérebro do prato de nove poços em 400 microliters de PBS fresco, gelado e sem nuclease em um prato de dissecação limpa, e use uma agulha de tungstênio resistente e uma lâmina de barbear fina para cortar limpamente cada olho do lobo óptico.
Quando todos os olhos de um lote tiverem sido removidos, transfira-os para um tubo de microcentrifuge estéril, sem RNase, e congele as amostras em nitrogênio líquido antes de prosseguir para o próximo lote. O olho pupal é um tecido de fácil acesso que serve como um excelente modelo para investigar processos de desenvolvimento, incluindo aqueles que conduzem morfogênese. Cerca de 40 horas após a formação do puparium, o arranjo final das células é alcançado.
Esta é uma idade ideal para avaliar as consequências de uma mutação genética ou expressão genética modificada. Por exemplo, seguindo a expressão ectópica do Diap1, um inibidor central da apoptose, o consequente aumento no número de células de rede pode ser comparado ao observado em uma retina de controle. A apoptose também pode ser avaliada mais diretamente utilizando anticorpos para ativar um caspase-1 da morte ou usando outras abordagens para detectar células moribundas.
Análises de manchas ocidentais de lises oculares podem ser usadas para determinar a presença ou expressão relativa de proteínas de interesse ou para comparar a expressão proteica em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento. É importante notar que dissecar mais de 60 olhos por genótipo ou condição experimental é ideal para isolar RNA suficiente de alta qualidade. O mais importante a ser lembrado é que a retina pupal é extremamente frágil, e muito cuidado deve ser tomado durante sua dissecação para garantir sua integridade.
