Actualmente, la inmunohistoquímica se utiliza con cada vez más frecuencia para identificar la presencia de marcadores moleculares específicos y sus cambios en el caso de patologías, dando raíces a la posibilidad de realizar análisis cuantitativos. La inmunohistoquímica, principalmente la técnica de inmunofluorescencia, se utiliza en el modelo de animales larvarios y adultos de peces cebra, pero poco se sabe sobre un buen protocolo de inmunohistoquímica estándar para el pez cebra. Aquí, describimos e ilustramos un protocolo que se puede utilizar para estudiar la conservación evolutiva de proteínas importantes en peces cebra adultos.
Un buen protocolo para la inmunohistoquímica en peces cebra adultos puede ayudar a subestimar la utilidad de este modelo animal para estudiar la expresión morfológica y la distribución de biomoléculas altamente conservadas. Este método también puede ayudar a analizar posibles alteraciones de estas biomoléculas debido a condiciones patológicas correlacionadas con la fisiopatología humana. Lea Tunisi, estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Para comenzar este procedimiento, transfiera los bloques de tejido congelado preparados a un criostato a menos 20 grados centígrados. Cortar el bloque en secciones coronales o sagitales de 10 micrómetros. A continuación, recoja los tejidos en secciones seriales alternativas en diapositivas de vidrio adhesivo adecuadas para inmunohistoquímica, y guárdelos a menos 20 grados centígrados hasta que estén listos para continuar.
En primer lugar, utilice una pluma resistente a disolventes para demarcar el área del tejido en la diapositiva. Enjuague las secciones tres veces durante cinco minutos cada una con un tampón de fosfato de 0,1 molares. A continuación, disuelva 0,3 mililitros de Tritón X-100 en 100 mililitros de tampón de fosfato 0,1-molar para preparar Triton X-100 0.3%Disuelve 0.1%normal suero de burro en tampón de fosfato que contenga 0.3%Triton X-100 para preparar la solución de bloqueo.
Incubar las secciones con la solución de suero de burro normal disuelto en tampón de permeabilización PB-Tritón X-100 0.3% durante 30 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar la membrana celular y bloquear los sitios de unión inespecíficos. Primero, enjuague las secciones tres veces durante cinco minutos cada una con un tampón de fosfato 0.1-molar. Añadir la mezcla de anticuerpos primarios diluidos en PB-T, e incubar las secciones durante la noche en una caja húmeda a temperatura ambiente.
Al día siguiente, enjuague las secciones tres veces durante cinco minutos cada una con tampón de fosfato 0.1-molar. Incubar secciones a temperatura ambiente durante dos horas en una mezcla adecuada de anticuerpos secundarios diluidos en PB-T. Para comenzar, enjuague las secciones tres veces durante cinco minutos cada una con tampón de fosfato 0.1-molar.
Disolver 1,5 microlitros de DAPI en tres mililitros de tampón de fosfato para preparar el colorante nuclear DAPI. Contraataque las secciones del tinte. A continuación, utilice el medio de montaje para cubrir las diapositivas para estabilizar el tejido y manchar para el uso a largo plazo.
Las muestras fluorescentes se pueden almacenar en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Repita el protocolo de inmunofluorescencia y omita el anticuerpo primario o secundario, o sustituya el antisuero primario o secundario por el tampón de fosfato para preparar el control negativo. A continuación, repita el protocolo de inmunofluorescencia y absorba previamente cada anticuerpo primario con un exceso del péptido relativo.
Repita el protocolo de inmunofluorescencia en rodajas de cerebro de ratón para preparar el control positivo. Usando un microscopio confocal equipado con una etapa motorizada X-Y-Z, una cámara digital y un software de adquisición y análisis, observe y analice las secciones inmunosutendas. Adquiera imágenes digitales con los objetivos 5x, 20x y 40x.
Tome imágenes de cada sección con bajo aumento en cada uno de los canales disponibles para componer un montaje de bajo aumento. Normalice las imágenes de fluorescencia al máximo contraste y superposición. En toda el área de interés, recopile pilas Z serie de imágenes a través de seis planos focales con pasos focales de uno a 1,8 micrómetros.
Realice esta colección para cada canal por separado. Después de esto, utilice el software de desconvolución de imágenes para desconvolucionar imágenes por aplicación de 10 iteraciones y contraer las imágenes del plano Z serie en una sola imagen de proyección máxima. Utilice un software de edición de imágenes adecuado para ajustar los micrografías para la luz y el contraste.
El análisis inmunohistoquímico de la distribución OX-A y OX-2R en el intestino del pez cebra adulto muestra diferentes sitios de localización de OX-A y OX-2R y sus aumentos en la expresión en las células intestinales del pez cebra DIO. Se observa una tinción marrón intensa para OX-A en las células del intestino medial y anterior. La inmunoexpresión de OX-A da señales claras en los diferentes compartimentos intestinales, disminuyendo desde el anterior hasta el intestino medial.
Se observan resultados similares para la inmunoexpresión OX-2R en el intestino de DIO y controlar el pez cebra dieta. Un aumento de la señal OX-A en el pez cebra adulto DIO se acompaña de la sobreexpresión de OX-2R en otros compartimentos intestinales. El análisis preciso de imágenes inmunofluorescentes muestra el aumento de la colocación OX-2R/CB1R en el intestino del pez cebra adulto DIO en comparación con la dieta de control del pez cebra.
Una situación similar se observa en diferentes regiones cerebrales, tales como el telencéfalo dorsal, hipotálamo, tectum óptico, torus lateralis, y núcleo difuso del lóbulo inferior. Mediante la doble inmunosumanidad con colocación orexin-A y CB1R, se observa que hubo un aumento de la colocación en las neuronas orexinérgicas del hipotálamo, acompañado de un aumento de la señal fluorescente orexin-A. Estos resultados muestran cómo la doble inmunofluorescencia puede ayudar a identificar la expresión de proteínas conservadas fisiológicamente, la colocación de las proteínas diana y sus cambios de distribución y/o expresión en diferentes condiciones patológicas.
Usando inmunofluorescencia, podemos entender mejor la codistribución y coexpresión de biomoléculas, sus posibles interacciones, y también podemos tener una imagen visible de sus cambios en caso de diferentes patologías. Además, la distribución neuroanatómica de la expresión o los receptores de enzimas metabólicas puede revelar aún más el papel de la señalización proteica dentro de los tejidos. El trabajo técnico actual introdujo el enfoque de inmunofluorescencia para estudiar dos sistemas altamente conservados, orexin y endocannabinoides, en el uso de un modelo de pez cebra adulto.
Usando este protocolo descrito aquí por primera vez en el cerebro del pez cebra adulto, no se ha determinado la distribución anatómica y la coexpresión de los receptores orexin-2 y los receptores endocannabinoide-CB1. Recomendamos los protocolos descritos aquí para experimentos de inmunohistoquímica y para detectar la distribución espacial y la organización de receptores en péptidos en peces cebra adultos para comprender mejor sus funciones.
