Delineamos un procedimiento para detectar y cuantificar el ácido iofenoxico en el suero de mangosta. Los resultados sugieren que el ácido iofenoxico puede utilizarse como marcador biológico para verificar la absorción beta en la especie. La principal ventaja de este método es que permite la cuantificación de análogos de ácido iofenoxico a partes por mil millones de niveles, utilizando una técnica de precipitación de proteínas fácil de realizar.
Para la fase móvil A, combine un mililitro de ácido fórmico con un litro de agua ultra pura. Para la fase B móvil, combine un mililitro de ácido fórmico con un litro de acetonitrilo. Para el diluyente, combine un mililitro de ácido trifluoroacético con 200 mililitros de acetonitrilo.
A continuación, pesar aproximadamente 10 miligramos de metilo-IPA en microbalance, y registrar la masa a más o menos 0001 miligramos. Transfiera cuantitativamente el metil-IPA a un matraz volumétrico de 10 mililitros clase A, utilizando cuatro a cinco mililitros de acetonitrilo. Sonicar durante un minuto para disolver todos los sólidos y luego llevar al volumen con acetonitrilo.
Transfiera aproximadamente ocho mililitros de cada material a viales de vidrio ámbar de ocho mililitros con tapas forradas con PTFE y almacene las muestras a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el stock restante a residuos peligrosos. Para la población de 25X, siete acciones de metil-IPA preparan un stock de metil-IPA y acetonitrilo a aproximadamente 200 microgramos por mililitro.
Transfiera un mililitro de la acción a un matraz de cinco mililitros y diluya al volumen con acetonitrilo. A continuación, transfiera el stock a un vial de vidrio ámbar de ocho mililitros con una tapa forrada de PTFE y guárdelo a temperatura ambiente. Con un pipeteador de repetición, prepare las seis existencias adicionales de metilo-IPA 25X descritas en el protocolo de texto en viales de vidrio ámbar de ocho mililitros con tapas forradas con PTFE y guárdelos a temperatura ambiente.
Para el stock suplente de 25X, transfiera 0,1 mililitros del stock concentrado de etil-IPA a un matraz volumétrico de clase A de 10 mililitros utilizando una jeringa de vidrio de 100 microlitros y luego diluya al volumen con acetonitrilo. Transfiera aproximadamente ocho mililitros de la población sustituta a un vial de vidrio ámbar de ocho mililitros con tapa forrada de PTFE y guárdela a temperatura ambiente. Transfiera el stock restante a residuos peligrosos.
A continuación, prepare 4X de stocks que contengan tanto metilo-IPA como etil-IPA en viales de muestreador automático de vidrio atornillado de 10 mililitros, como se describe en el protocolo de texto. Por ejemplo, para preparar el stock 4X7, agregue 0,2 mililitros de la población 25X siete de dimetil-IPA a un vial de dos mililitros utilizando el pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mililitros. Agregue 0,2 mililitros de la población de etil-IPA suplente 25X utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mililitros.
Añadir 0,85 mililitros de acetonitrilo utilizando un pipettor de repetición con una punta de capacidad de un mililitro. Tapa el vial de forma segura e invierte cinco veces para mezclar. Después de esto, prepare la curva estándar en dos viales de muestreador automático atornillados de tornillo de mililitro como se describe en el protocolo de texto.
Por ejemplo, para preparar siete estándar, agregue 0,2 mililitros de la acción 4X7 a un vial de dos mililitros, utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mililitros. Agregue 0,6 mililitros de agua ionizada de ultra pureza utilizando un pipeteador repetido con una punta de capacidad de un mililitro. Tapa los viales de forma segura e invierte cinco veces para mezclar.
Para cada muestra, prepare un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros que contenga de 200 a 300 miligramos de cloruro de sodio y coloque los tubos en un estante de plástico de 80 posiciones. Para cada muestra, etiquete un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros como A y un segundo tubo de micro centrífuga como B.Arrange los tubos en un estante de plástico de 80 posiciones. Coloque los siguientes materiales y equipos necesarios para la extracción de suero en un gabinete de bioseguridad de clase dos: los tubos de micro centrífuga, un mezclador de vórtice, un pipeteador repetido con 0,5 mililitros y cinco mililitros de capacidad, una pipeta de desplazamiento de aire de 100 a 1000 microlitros con 1000 puntas de microlitro, recipientes con aproximadamente 100 mililitros cada uno de agua ionizada diluyente y ultra pureza, y contenedor de residuos de riesgo biológico.
A continuación, retire las muestras de suero del almacenamiento congelado y caliente a temperatura ambiente en el gabinete de bioseguridad. El vórtice mezcla cada muestra de suero antes del muestreo. Usando un pipeteador repetido con una punta de capacidad de 0,5 mililitros, dispensar 05 mililitros de suero de mangosta en el tubo A y añadir 05 mililitros de la culata suplente 25X.
A continuación, agregue 0,95 mililitros de diluyente al tubo A utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de cinco mililitros. Tapa los tubos de forma segura y el vórtice se mezcla durante 10 a 15 segundos. A continuación, agregue el suero de mangosta de control al tubo A.Fortify cada una de las muestras 4QC con me-IPA utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mililitros.
Añada material suplente 25X a las muestras de control de calidad. A continuación, agregue el diluyente a las muestras de control de calidad. Tapa los tubos y la mezcla de vórtice.
Dispensar el cloruro de sodio prepesado en el tubo A y la mezcla de vórtice tres veces durante ocho a 12 segundos. A continuación, limpie las superficies exteriores del bastidor del vial que contiene el tubo A utilizando 70%isopropanol. Después de retirar las muestras del gabinete de bioseguridad, el tubo centrífugo A a 1200 veces G durante un minuto para separar las fases acuosa y acetonitrilo.
Pipetear 0,8 mililitros de la fase de acetonitrilo superior al tubo B, utilizando una pipeta de desplazamiento de aire de 100 a 1000 microlitros. Transfiera la solución restante en el tubo A a residuos peligrosos y deseche el tubo vacío en un contenedor de residuos biopeligroso. Ahora, retire el acetonitrilo y el trifluoroacético del tubo B con un flujo suave de gas nitrógeno en un baño de agua de 45 grados Celsius.
Añadir 0,25 mililitros de acetonitrilo al tubo B utilizando un pipeteador de repetición y una mezcla de vórtice durante cuatro a cinco segundos. Luego, centrifugar a 1200 veces G durante dos a cuatro segundos para recoger el líquido en la parte inferior del tubo. Después de la centrifugación, agregue 0,75 mililitros de agua desionizada ultra pura al tubo B utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de cinco mililitros y una mezcla de vórtice durante cuatro a cinco segundos.
Centrifugar a 1200 veces G durante un minuto para aclarar la muestra. A continuación, transfiera 0,75 mililitros del sobrenadante a un vial de muestreador automático utilizando una pipeta de desplazamiento de aire de 1000 microlitros y deseche las puntas de pipeta en el contenedor de residuos de riesgo biológico. Tapa cada vial de muestreador automático de forma segura para el análisis LC-MS/MS.
Transfiera la solución restante en el tubo B a residuos peligrosos y deseche el tubo vacío en un contenedor de residuos biopeligroso. Configure el LC-MS/MS con todos los parámetros descritos en el protocolo de texto. Encienda el LC-MS/MS y permita que la columna alcance los 70 grados centígrados antes de establecer el caudal en 0,8 mililitros por minuto.
Configure una secuencia en el software de adquisición de datos para inyectar la curva estándar antes y después de cada lote que consta de muestras de control de calidad y muestras desconocidas. Inyectar todas las normas y muestras y adquirir cromatogramas de iones MR utilizando los parámetros enumerados en el protocolo de texto. Después de la finalización de la secuencia, apague el LC-MS/MS y deseche todos los viales de muestreador automático en residuos peligrosos.
El cromatograma iónico del suero de mangosta de control ilustra el tiempo de retención de etil-IPA y la ausencia de metilo-IPA en el tiempo de retención indicado. El cromatograma iónico de la muestra de control de calidad ilustra la separación basal de metilo-IPA de etil-IPA, así como las transiciones de cuantificador y calificador para metilo-IPA. El cromatograma iónico de la muestra representativa del estudio muestra una concentración sérica observada de 33,5 microgramos por microlitro de metil-IPA.
Los resultados de precisión y precisión para controlar el suero de mangosta fortificados con metil-IPA se muestran aquí. El porcentaje de recuperaciones osciló entre 96,9 y 109%La desviación relativa porcentual en los tres niveles de fortificación fue del 3,4%1,7% y del 2,3%, respectivamente. Los resultados de precisión y precisión para el control del suero de mangosta fortificados con etil-IPA se muestran aquí.
Porcentaje de recuperaciones osciló entre 89,5 y 115%La desviación estándar relativa porcentual en los cinco niveles de fortificación fue del 4,3%1,5%2,3%5,6% y 1,1%, respectivamente. Todas las mangostas ofrecían cebos de etil-IPA y metil-IPA consumieron al menos el 25% del cebo dentro de la restricción de tiempo de 24 horas y tenían niveles cuantificables de etil-IPA y metil-IPA en sus sueros, respectivamente. La utilidad potencial del método podría aumentarse configurando el LC-MS para recopilar datos para otros análogos del ácido iofenoxico, como el ácido yofenoxico de propilo y el butilo.
Alentamos al personal a consultar las recomendaciones más recientes del comité consultivo sobre prácticas de inmunización o de su comité institucional de bioseguridad para obtener orientación sobre si es necesaria la vacunación preexposición contra la rabia. Las secciones 2.3 a 2.6 de este protocolo que impliquen trabajar con suero sin diluir deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase dos.
