Los DREADD son el enfoque quimiogenético más popular para el control remoto de la actividad neuronal. Aquí ofrecemos nuevas alternativas para el control repetitivo o crónico de DREADD, centrándonos en métodos de administración de CNO menos invasivos. Describimos dos estrategias para el parto prolongado de CNO en ratones por gotas repetitivas, o crónicamente a través del agua potable del animal.
Los protocolos descritos aquí son ejemplos de opciones crónicas y no invasivas para el parto CNO que se pueden adaptar a una variedad de diseños experimentales, incluyendo diferentes variantes DE DREADD, tejidos, o incluso especies. Un problema clave para un parto con CNO es el estrés y el dolor de un animal. Estos protocolos minimizan este problema y son fáciles de realizar y adaptar a diferentes configuraciones experimentales.
Antes de realizar la cirugía, limpie y esterilizar el marco estereotaxico y todos los instrumentos necesarios. Cuando el marco esté listo, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo en un ratón macho de tipo salvaje de fondo mezclado anestesiado, afeite la parte superior de la cabeza y fije la cabeza del ratón al marco. A continuación, aplique lubricante protector ocular en los ojos y, finalmente, limpie la piel expuesta con yodo povidona secuencial y exfoliantes de etanol al 70%.
Usa un bisturí estéril para exponer el cráneo y calibrar el marco hasta el punto de bregma. Taladre en una coordenada medialateral de 2,9 milímetros, y una coordenada posterior anterior de menos 2,7 milímetros para apuntar al hipocampo. Cuando el cerebro esté expuesto, utilice un micro inyector y pipetas microcapilares para inyectar unilateralmente 90 nanolitros del virus adenoociado en el hipocampo a una profundidad ventral dorsal de menos tres milímetros.
A continuación, cierre la incisión con suturas de nylon y retire al animal del marco para la administración de analgesia. Para el parto repetitivo de CNO, comenzando cuatro semanas después de la inyección, aclimatar a los animales a la manipulación desaliñando cada ratón tres minutos al día durante tres a cuatro días antes de la administración de las gotas para los ojos. Cuando los ratones se han aclimatado a la manipulación, pesar cada ratón para determinar la cantidad adecuada de CNO para ser entregado para lograr un un miligramo de CNO por kilogramo de concentración de peso corporal.
Dos horas antes de apagar las luces durante la fase inactiva, cargue de una a tres microlitros de la solución CNO preparada en una micropipeta P10 e inmovilice el ratón a través de la desaliñada. Expulse lentamente la solución hasta que se forme una gota estable en la punta de la pipeta y lleve cuidadosamente la gota cerca de la córnea hasta que la solución se entregue sin tocar la punta de la pipeta al ojo del ratón. A continuación, devuelva el ratón a su jaula de origen antes de aplicar la gota de CNO en el ojo del siguiente animal.
En los casos en que el CNO deba entregarse durante la fase activa del ratón, asegúrese de que se haya atenuado la luz roja para una manipulación adecuada del animal y la entrega de CNO. Para el tratamiento crónico de CNO, a partir de cuatro semanas después de la inyección y tres días antes de comenzar el tratamiento, sustituya las botellas de agua regulares por botellas pequeñas detenidas con boquillas de goma y cubiertas con papel de aluminio que contenga 10 mililitros de agua regular. Asegure a las jaulas con cinta adhesiva para permitir que los ratones se aclimaten a las botellas.
Mida el consumo diario de agua para cada ratón y pese cada ratón. Pruebe un rango de concentraciones de CNO para determinar la dosis que muestra la máxima eficacia con la concentración mínima de CNO. A continuación, llene cada botella pequeña con ocho mililitros de agua regular más la cantidad requerida de CNO.
Para el tratamiento restringido de CNO, comenzando cuatro semanas después de la inyección y tres días antes de comenzar el tratamiento, coloque un frasco pequeño que contenga 10 mililitros de agua más 1% sacarosa en la jaula lejos de la botella de agua original durante la última porción de la fase activa del animal. Al final de la exposición, retire el agua más las soluciones de sacarosa de cada jaula y mida el consumo de agua de sacarosa para cada animal. Para la entrega de CNO, llene las botellas con cinco mililitros de agua más 1%sacarosa y un miligramo por kilogramo de CNO.
Coloque el frasco en la misma posición que durante el período de aclimatación del agua azucarada durante la última parte de la fase activa, retirando las botellas y midiendo la cantidad de agua, sacarosa y CNO consumida como se ha demostrado. Al final del experimento, cosecha el cerebro animal tratado en un fijador fresco. Después de 9 a 12 horas, crioproteger el tejido cerebral en una solución de 30%sacarosa.
Cuando el cerebro se hunde, secciona la muestra en un criostato. Cuando se hayan obtenido todas las secciones cerebrales y se haya bloqueado la unión inespecífica, incubar las muestras de tejido con una solución de anticuerpos anti-c-Fos a cuatro grados Celsius durante la noche con agitación constante. A la mañana siguiente, lave las muestras con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco por lavado antes de incubar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado.
Después de una hora a temperatura ambiente y agitación constante protegida de la luz, obtenga imágenes digitales de las secciones tisulares etiquetadas mediante microcroscopia confocal de fluorescencia. Después de cargar las imágenes en ImageJ, describa al medir las áreas de las células positivas mCherry infectadas asociadas a Adeno y cuantifique el número de celdas falsas positivas de C dentro de esta región para obtener el número de celdas activadas por área. La entrega repetitiva de CNO con gotas para los ojos provoca una sólida inducción de la expresión de cFos en la mayoría de las neuronas infectadas que demuestra que la eficacia del parto con CNO se mantiene durante la exposición repetitiva.
Además, se observa una inducción significativa de cFos en muestras recogidas dos horas después del tratamiento con CNO en comparación con las muestras obtenidas seis horas después de la exposición a CNO, lo que indica que los cambios inducidos por CNO dependen del tiempo. El consumo diario de agua más CNO no es significativamente diferente en comparación con el volumen total de agua regular consumida. Del mismo modo, la cantidad de agua más el 1% de sacarosa consumida durante la noche no se ve afectada por la adición de CNO, ni las diferencias en el consumo diario de agua más CNO, y el agua más sacarosa más CNO se observan durante un período experimental de cinco días.
Al igual que la aplicación de gotas para los ojos CNO, se observa una inducción robusta de cFos después de dos, pero no seis horas de acceso al agua potable CNO. Además, existe un umbral claro de eficacia para el CNO, ya que una dosis baja de CNO no provoca la activación de cFos en comparación con un control salino, mientras que dosis más altas inducen una inducción de cFos robusta y similar. Recomendamos realizar un análisis de respuesta a la dosis para definir la dosis más baja de CNO que no reduce significativamente la activación neuronal, y teniendo en cuenta el uso de clozapina como un ligando.
Aquí demostramos el uso de la inducción de cFos mediada por CNO como resultado de la activación neuronal. Sin embargo, estos protocolos se pueden adoptar fácilmente para análisis electrofisiológicos o pruebas de comportamiento. La tecnología DREADD es una poderosa herramienta para el control remoto de la actividad neuronal y el diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO.
Aumentaremos el espectro de opciones para entornos experimentales e intervenciones clínicas potenciales.
