Drosophila melanogaster es un potente modelo para evaluar in vivo los posibles efectos tóxicos y endocrinos de los productos químicos, como los disruptores endocrinos, que representan un grave problema para la salud humana y los entornos naturales. Abordar el efecto de los EDC en los rasgos hormonales de la vida de la mosca, como la fecundidad, la fertilidad, el tiempo de desarrollo y la vida útil. Es una manera fácil, barata y rápida de investigar la interrupción endocrina in vivo.
La fertilidad, el desarrollo y la vida útil de Drosophila pueden verse afectados por varios factores que deben controlarse cuidadosamente para garantizar el resultado exitoso de este protocolo. Por lo tanto, se requiere la máxima atención en la cría y manipulación de moscas. Para ensayar el sabor de la EDC seleccionada, después de la anestesia, transfiera 15 moscas jóvenes del lecho de mosca a cuatro viales paralelos que contengan un medio de harina de maíz mezclado con un colorante alimentario.
El vial de control contiene el disolvente solo, y los otros tres viales se complementan con diferentes dosis de los EDC seleccionados. Conservar los viales en una incubadora humidificada durante un día con una luz natural de 12 horas. Después de anestesiar las moscas de nuevo, transfiera las moscas inmovilizadas a un papel blanco, y colóquelo bajo un microscopio estéreo para observar.
Compare la coloración abdominal de cada grupo de tratamiento con respecto al grupo de control. Para ensayar el rendimiento reproductivo de las moscas, prepare tres viales de moscas para cada EDC como viales parentales, con ocho hembras y cuatro machos en 10 mililitros de medio de harina de maíz complementados con EE2. Para el control, preparar seis viales de moscas, cada uno con ocho hembras y cuatro machos en 10 mililitros de alimentos medianos de harina de maíz complementados con disolvente EE2.
Vuela en una incubadora a 25 grados centígrados. Durante su desarrollo, evite el hacinamiento de las larvas. Después de cuatro días, invierta cada vial sobre un etherizer para retirar a los padres y devolver los viales a la incubadora durante cinco días más.
A última hora de la tarde del día nueve, invierta cada vial sobre un etherizer para eliminar todas las moscas recién emergidas de los viales y coloque los viales en otra incubadora a 18 grados centígrados durante la noche. En la mañana del día 10, en una estación de trabajo de dióxido de carbono Drosophila, invierta cuidadosamente el vial de cultivo para evitar que las moscas anestesiadas caigan en el medio e inserte un tubo de goma con una aguja en el vial entre el tapón de algodón y la pared del vial. Abra la válvula para suministrar dióxido de carbono.
En cuestión de segundos, transfiera las moscas a un lecho de mosca bajo un microscopio. Recoger hembras vírgenes y machos jóvenes por separado en dos grupos en la cama de la mosca. Subdividir aleatoriamente cada grupo de moscas en pequeños subgrupos, con 10 hembras o 20 machos por vial llenos de medio de harina de maíz fresco correspondiente.
Continuar la incubación y recoger 30 hembras vírgenes y 30 machos por cada EDC, y 90 hembras vírgenes y 90 machos para el control. Alberga a estos grupos de moscas a 25 grados centígrados hasta que tengan cuatro días de edad después de la eclosión. A continuación, transfiéralos a viales nuevos que contengan el medio fresco correspondiente cada dos días.
Compruebe que no hay larvas en los viales de las hembras. A continuación, etiquete los viales con una serie diferente de números secuenciales para el siguiente tratamiento. Después de la anestesia, transfiera una hembra tratada con disolvente EE2 a un pequeño vial que contenga un medio de tomate de harina de maíz fresco sin EE2 y agregue un macho tratado con disolvente EE2 para el control.
Emparejar a un macho tratado con EE2 con una hembra tratada con disolvente EE2 o una hembra tratada con EE2 con un macho tratado con disolvente EE2 para cada tratamiento. Casa 20 cruces individuales a 25 grados centígrados. Transfiera cada par de apareamiento a viales medianos de tomate de harina de maíz fresco sin EDC todos los días durante los siguientes 10 días.
Inspeccione visualmente cada vial todos los días en busca de los óvulos e informe su número en la hoja de cálculo de fertilidad. En cada vial, compruebe atentamente si hay moscas recién emergidas y registre el número diario de progenies adultas durante el período de 10 días. Después de 10 días desde el apareamiento inicial, retire a los padres de la última serie de viales.
En los protocolos de ensayo de eclosión, en primer lugar, para cada grupo de tratamiento, se establecen 10 viales de moscas jóvenes y sanas de menos de dos días de edad, cada una con seis hembras y tres machos en 10 mililitros de alimentos de harina de maíz sin EDC. Trasera las moscas en la comida durante 24 horas y deja que se aparees. A continuación, prepare otros 10 viales paralelos por grupo de tratamiento con 10 mililitros cada uno de alimentos frescos de harina de maíz complementados con diferentes concentraciones de EDC o el disolvente EE2 solo para el control.
Transfiera las moscas apareadas a estos nuevos viales. Haga una hoja de cálculo de desarrollo para grabar las diferentes series. Deje que las moscas pongan huevos durante 16 horas.
Luego, retire a los padres de los viales. Incubar los viales a 25 grados centígrados durante tres a cuatro días, o hasta que las larvas errantes sean visibles. Cada día, cuente el número de pupas nuevas en cada vial escribiendo un número en secuencia por cada pupa en el exterior del vial para evitar contar la misma pupa dos veces.
Informar del número de pupas recién surgidas durante tres a cuatro días, o hasta que no se forme más pupas. A partir del día nueve, cuente el número de adultos emergentes diariamente, hasta que no surjan más adultos. Informar sobre la hoja de cálculo del desarrollo y realizar el resto del ensayo de eclosión de acuerdo con el manuscrito.
En el protocolo de vida útil, primero se instalaron 20 viales con ocho hembras y cuatro machos, cada uno lleno de 10 mililitros de alimentos de harina de maíz y los albergan a 25 grados centígrados. Después de cuatro días, deseche las moscas y vuelva a colocar los viales en la incubadora. A última hora de la tarde del día nueve, retire todas las moscas recién emergidas de los viales y devuelva los viales a la incubadora.
Después de 16 a 24 horas, divida 250 moscas adultas de un día de edad de ambos sexos en cuatro grupos bajo anestesia de dióxido de carbono ligero y transfieralas a botellas de 250 mililitros que contengan alimentos medianos para adultos, tres complementados con diferentes concentraciones de EDC y uno con el disolvente EE2 solo. Mantenga las moscas a 25 grados centígrados durante dos o tres días para permitir que se aparecen. Luego, ordene cada cohorte de moscas por sexo en dos grupos.
Dentro de cada condición de tratamiento, para ambos sexos, subdividir aleatoriamente cada grupo en cinco viales paralelos a una densidad de 20 individuos por vial. Prepare una hoja de cálculo de vida útil en la que el número de moscas muertas se resta del número de moscas supervivientes de la transferencia anterior, de modo que el número de supervivientes en cada transferencia se obtenga automáticamente. Después de tres días, transfiera las moscas sin anestesia a nuevos viales que contengan los alimentos correspondientes al mismo tiempo y compruebe la muerte.
Registre la edad de las moscas y el número de moscas muertas. Repita la transferencia cada tres días hasta que todas las moscas mueran. En este experimento, las curvas de vida útil se trazaron como la supervivencia acumulativa frente a los días transcurridos para cada concentración de la EDC y el control.
Para el control, después de un largo período inicial en el que la curva de supervivencia se mantuvo relativamente alta, disminuyó exponencialmente después de unos 60 días. Después de la exposición de la EDC, la curva de supervivencia de las moscas tratadas se vio afectada significativamente y mostró una disminución dramática después de 36 días. Se aconseja acerca de que los viales paralelos en análisis deben ser muy similares, de lo contrario será difícil entender cuál desechar.
Por lo tanto, sugerimos tener mucho cuidado, adoptando una buena práctica experimental, utilizando un gran tamaño de muestra. Siguiendo estos protocolos, también es posible evaluar el impacto transgeneracional de un disruptor endocrino seleccionado, así como probar los posibles efectos aditivos de una combinación de diferentes disruptores endocrinos.
