ショウジョウバエメラノガスターは、人間の健康や自然環境に深刻な問題を示す内分泌破壊物質などの化学物質の潜在的な毒性および内分泌効果をインビボで評価する強力なモデルです。EDCがハエのホルモン生命特性(例えば、胎児性、生殖能力、発達時間、寿命)に及ぼす影響に対処する。これは、インビボで内分泌破壊を調査するための簡単で安価で迅速な方法です。
ショウジョウバエの生殖能力、発達、寿命は、このプロトコルの成功した結果を確実にするために慎重に制御されなければならないいくつかの要因の影響を受ける可能性があります。そのため、ハエの飼育や取り扱いには最大限の注意が必要です。選択したEDCの味をアッセイするために、麻酔後、フライベッドから15匹の若いハエを、食品着色料と混合したコーンミール培地を含む4つの平行バイアルに移す。
対照バイアルは、単独で溶媒を含み、他の3つのバイアルは、選択されたEDCの異なる用量で補充されます。天然の12時間の光で1日、加湿インキュベーターにバイアルを保管してください。ハエを再び麻酔した後、固定されたハエを白紙に移し、ステレオ顕微鏡の下に置いて観察します。
対照群に対して各治療群の腹部着色を比較する。ハエの生殖性能をアッセイするには、EE2を補充したコーンミール培地の10ミリリットルに8人のメスと4人の男性を含む、親のバイアルとして各EDCのためのハエの3つのバイアルを準備する。コントロールのために、EE2溶媒を補充したコーンミール中食品の10ミリリットルに8匹のメスと4人の男性をそれぞれ8匹のハエのバイアルを準備します。
リアは摂氏25度のインキュベーターで飛ぶ。彼らの開発中に、幼虫を過密にしないでください。4日後、エーテルを介して各バイアルを反転して両親を取り除き、バイアルを5日間インキュベーターに戻します。
9日目の午後遅く、エータライザーの上に各バイアルを反転して、バイアルから新たに出現したすべてのハエを取り除き、バイアルを一晩摂氏18度の別のインキュベーターに入れます。10日目の朝、ショウジョウバエの二酸化炭素ワークステーションで、麻酔されたハエが媒体に落ちるのを防ぐために培養バイアルを慎重に反転させ、綿のストッパーとバイアルの壁の間のバイアルに針を持つゴムチューブを挿入します。バルブを開けて二酸化炭素を供給します。
ほんの数秒で、ハエを顕微鏡でフライベッドに移します。処女女性と若い男性を別々にハエベッドの2つのグループに集めます。小さなサブグループのハエの各グループをランダムに細分化し、10匹のメスまたは20匹の雄が新鮮な対応するコーンミール培地で満たされたバイアルあたり。
インキュベーションを続け、各EDCに対して30人の処女女性と30人の男性、そして90人の処女女性と90人の男性を集めてコントロールします。エローション後4日になるまで、これらのハエのグループを摂氏25度で収容してください。その後、2日ごとに新鮮な対応する媒体を含む新しいバイアルにそれらを転送します。
メスのバイアルに幼虫がいないか確認してください。次に、バイアルに次の処置のための連続番号の異なるシリーズをラベル付けします。麻酔後、EE2溶媒処理メス1匹をEE2なしで新鮮なコーンミールトマト培地を含む小さなバイアルに移し、EE2溶媒処理された男性を1匹加えて制御します。
EE2処理の男性とEE2溶媒処理雌またはEE2処理雌とEE2溶媒処理の男性を各処理に対して組み合わせる。25°Cで家20シングルクロス。各交配ペアを、その後の10日間、毎日EDCなしで新鮮なコーンミールトマト培地バイアルに移します。
卵のために毎日各バイアルを視覚的に検査し、不妊治療スプレッドシートに自分の番号を報告します。各バイアルでは、新しく出現したハエを注意深くチェックし、10日間の成人子孫の毎日の数を記録します。最初の交配から10日後、バイアルの最後のシリーズから両親を取り除きます。
エローションアッセイプロトコルでは、まず、各治療群に対して、生後2日以内に生後2日以内に生後2日以内に10個の若くて健康なハエのバイアルを設置し、それぞれEDCなしのコーンミール食品の10ミリリットルに6人の女性と3人の男性を設置する。ハエを24時間食べ物に乗せ、交尾できるようにします。次に、異なるEDC濃度またはEE2溶媒単独で補った新鮮なコーンミール食品のそれぞれを10ミリリットルで処理グループごとに別の10並列バイアルを調製し、コントロールします。
交配ハエをこれらの新しいバイアルに移します。異なるシリーズを記録するために、開発用スプレッドシートを作成します。ハエが16時間卵を産むことを許可します。
次に、バイアルから両親を取り除きます。バイアルを摂氏25度で3~4日間、または放浪の幼虫が見えるまでインキュベートする。毎日、バイアルの外側に各子犬の順序で番号を書くことによって、各バイアルの新しい子犬の数を数え、同じ子犬を2回数えないようにします。
新たに出現した子犬の数を3〜4日間、またはこれ以上の子犬の形がなくなるまで報告する。9日目から、成人が出現しなくなるまで、毎日新興成人の数を数えます。開発スプレッドシートに報告し、原稿に従って残りのエクロスションアッセイを実行します。
寿命プロトコルでは、最初に8人の女性と4人の男性で20バイアルを設置し、それぞれが10ミリリットルのコーンミール食品で満たされ、摂氏25度で収容します。4日後、ハエを捨て、バイアルをインキュベーターに戻します。9日目の午後遅く、バイアルから新しく出現したすべてのハエを取り除き、バイアルをインキュベーターに戻します。
16〜24時間後、両性の250匹の1日齢の成体ハエを軽い二酸化炭素麻酔下で4つのグループに分け、成人培地食品を含む250ミリリットルのボトルに移し、3つは異なるEDC濃度で補い、1つはEE2溶媒だけで補う。ハエを2〜3日間摂氏25度に保ち、交尾できるようにします。その後、性別によってハエの各コホートを2つのグループに分類します。
各治療条件内では、男女ともに、各グループを1バイアルあたり20個の密度でランダムに5つの平行バイアルに細分化する。死んだハエの数を以前の転送から生き残ったハエの数から差し引く寿命スプレッドシートを準備し、各転送で生存者の数が自動的に得られるようにします。3日後、麻酔なしでハエを対応する食物を含む新しいバイアルに同時に移し、死亡を確認する。
ハエの年齢と死んだハエの数を記録します。すべてのハエが死ぬまで3日ごとに転送を繰り返します。この実験では、寿命曲線を、各EDC濃度および対照の累積生存期間と経過日数に対してプロットした。
この対照については、生存曲線が比較的高いままであった長い初期期間の後、約60日後に指数関数的に低下した。EDC曝露後、治療されたハエの生存曲線は有意に影響を受け、36日後に劇的な減少を示した。分析の下で平行バイアルは非常に似ているべきである、そうでなければ、どちらを破棄するかを理解することは困難であることをお勧めします。
したがって、我々は、大きなサンプルサイズを使用して、良い実験の練習を採用し、細心の注意を払ってお勧めします。このプロトコルに従って、選択された内分泌破壊物質の世代間の影響を評価するだけでなく、異なる内分泌破壊物質の組み合わせの潜在的な添加効果を試験することもできる。
