Drosophila melanogaster является мощной моделью для оценки in vivo потенциального токсического и эндокринного воздействия химических веществ, таких как эндокринные разрушители, которые представляют собой серьезную проблему для здоровья человека и природной среды. Решение влияние ЭДК на гормональные черты жизни мухи, такие как плодовитость, плодовитость, время развития, и продолжительность жизни. Это простой, дешевый и быстрый способ исследовать эндокринные нарушения in vivo.
На фертильность, развитие и продолжительность жизни в Дрозофиле может повлиять несколько факторов, которые должны быть тщательно проутрены, чтобы обеспечить успешный результат этого протокола. Поэтому требуется максимальное внимание при воспитании и обработке мух. Чтобы почувствовать вкус выбранного ЭДК, после обезболивания перенесите 15 молодых мух с лету на четыре параллельных флакона, содержащих кукурузную муки, смешанную с пищевой окраской.
Контрольный флакон содержит только растворитель, а три других флакона дополняются различными дозами отобранных ЭДК. Держите флаконы во влажном инкубаторе в течение одного дня с естественным 12-часовым светом. После обезболивания мух снова, передать обездвиженной мух на белую бумагу, и поместить его под стерео микроскоп для наблюдения.
Сравните окраску брюшной полости каждой группы лечения по отношению к контрольной группе. Чтобы продать репродуктивную работоспособность мух, подготовь три флакона мух для каждого EDC в качестве родительских флаконов, с восемью самками и четырьмя самцами в 10 миллилитров кукурузной муки среды, дополненной EE2. Для контроля, подготовить шесть флаконов мух, каждая из которых восемь самок и четыре мужчины в 10 миллилитров кукурузной муки средней пищи, дополненной EE2 растворителя.
Задние мухи в инкубаторе при 25 градусах по Цельсию. Во время их развития избегайте перенаселенности личинок. Через четыре дня, инвертировать каждый флакон над эфиризатором, чтобы удалить родителей и вернуть флаконы в инкубатор еще на пять дней.
Во второй половине дня девять, инвертировать каждый флакон над эфиризатором, чтобы удалить все вновь возникшие мухи из флаконов и положить флаконы в другой инкубатор при 18 градусов по Цельсию в одночасье. Утром 10-го дня на рабочей станции по работе с углекислым газом Drosophila тщательно инвертировать культурный флакон, чтобы предотвратить падение анестезировалых мух на средний и вставить резиновую трубку с иглой во флакон между хлопчатобумажной пробкой и стенкой флакона. Откройте клапан для доставки углекислого газа.
В течение нескольких секунд, передача мух на кровать мухи под микроскопом. Соберите девственных самок и молодых самцов отдельно на две группы на лету кровать. Случайно подраздеть каждую группу мух в небольших подгруппах, с 10 самок или 20 мужчин на флакон заполнены свежей соответствующей среды кукурузной муки.
Продолжить инкубацию и собирать 30 девственных женщин и 30 мужчин для каждого EDC, и 90 девственных женщин и 90 мужчин для контроля. Дом этих групп мух при 25 градусов по Цельсию, пока они не в возрасте четырех дней после выкупа. Затем перенесите их в новые флаконы, содержащие свежие соответствующие среды каждые два дня.
Проверьте Есть нет личинок во флаконах самок. Затем этикетка флаконы с другой серии последовательных номеров для следующего лечения. После анестезии перенесите одну самку, обработанную растворителем EE2, в небольшой флакон, содержащий свежую томатную среду из кукурузной муки без EE2, и добавьте одного мужчину, обработанного растворителем EE2, для контроля поперек.
Соедините мужчину, обработанного EE2, с женщиной, обработанной растворителем EE2, или женщиной, обработанной EE2, с мужчиной, обработанным растворителем EE2 для каждого лечения. Дом 20 одиночных крестов при 25 градусах по Цельсию. Передача каждой пары спаривания на свежие кукурузные муки томатных средних флаконов без EDC каждый день в течение последующих 10 дней.
Визуально осмотрите каждый флакон каждый день для яичек и сообщите их номер на таблице плодородности. В каждом флаконе внимательно проверяйте наличие новых мух и записывайте ежедневное количество взрослых progenies в течение 10-дневного периода. Через 10 дней после первоначального спаривания удалите родителей из последней серии флаконов.
В протоколах анализа, во-первых, для каждой группы лечения, создано 10 флаконов молодых, здоровых мух менее двух дней, каждый с шестью женщинами и тремя мужчинами в 10 миллилитров кукурузной муки пищи без EDC. Задняя мух на питание в течение 24 часов и дать им спариваться. Затем приготовьте еще 10 параллельных флаконов в группе обработки с 10 миллилитров каждый из свежих кукурузной муки пищи, дополненной различными концентрациями EDC или EE2 растворитель только для контроля.
Перенесите спариваемые мухи на эти новые флаконы. Сделайте таблицу разработки для записи различных серий. Разрешить мухам откладывать яйца в течение 16 часов.
Затем удалите родителей из флаконов. Инкубировать флаконы при 25 градусах по Цельсию в течение трех-четырех дней, или до блуждающих личинок видны. Каждый день, подсчитайте количество новых куколок в каждом флаконе, написав число в последовательности каждой куколки на внешней стороне флакона, чтобы избежать подсчета же куколки в два раза.
Сообщите о количестве вновь возникших куколок в течение трех-четырех дней, или до тех пор, пока не будет больше куколки форме. Начиная с девятый день, подсчитайте число новых взрослых ежедневно, пока не появится больше взрослых. Сообщите об этом в таблице разработки и выполните остальную часть анализа по исключению в соответствии с рукописью.
В протоколе продолжительности жизни, сначала создано 20 флаконов с восемью самками и четырьмя самцами, каждый из которых заполнен 10 миллилитров кукурузной муки пищи и дома их при 25 градусов по Цельсию. Через четыре дня отбросьте мух и поместите флаконы обратно в инкубатор. Во второй половине дня девять, удалить все вновь возникшие мухи из флаконов и вернуть флаконы в инкубатор.
Через 16-24 часа разделите 250 однодневных взрослых мух обоих полов на четыре группы под легким наркозом двуокиси углерода и перенесите их в 250-миллилитровые бутылки, содержащие взрослую средняю пищу, три из которых будут дополнены различными концентрациями EDC и одну только растворителем EE2. Поддерживайте мух при 25 градусах по Цельсию в течение двух-трех дней, чтобы позволить им спариваться. Затем сортируют каждую когорту мух по полу на две группы.
В каждом лечении условие, для обоих полов, случайным образом подраздеть каждую группу на пять параллельных флаконов при плотности 20 человек на флакон. Подготовь таблицу продолжительности жизни, в которой количество мертвых мух вычитается из числа выживших мух из предыдущей передачи, так что количество выживших при каждой передаче автоматически получается. Через три дня перенесите мух без анестезии на новые флаконы, содержащие соответствующую пищу, и проверьте на смерть.
Запись возраста мух и количество мертвых мух. Повторяйте передачу каждые три дня, пока все мухи не умрут. В этом эксперименте кривые продолжительности жизни были построены как совокупный выживший по сравнению с истекшей дней для каждой концентрации EDC и контроля.
Для контроля, после длительного начального периода, в котором кривая выжившего оставалась относительно высокой, она снизилась в геометрической прогрессии примерно через 60 дней. После воздействия EDC, кривая выжившего обработанных мух была затронута значительно и показал резкое снижение после 36 дней. Сообщается, что параллельные флаконы, на которые идет анализ, должны быть очень похожи, иначе будет трудно понять, от чего отказаться.
Поэтому мы предлагаем с большой осторожностью, приняв хорошую экспериментальную практику, используя большой размер выборки. Следуя этим протоколам, можно также оценить трансгенеративное воздействие выбранного эндокринного разрушителя, а также проверить потенциальное аддитивное воздействие сочетания различных эндокринных разрушителей.
