Drosophila melanogaster הוא מודל רב עוצמה כדי להעריך vivo את ההשפעות הרעילות והאנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקלים, כגון משבשים אנדוקריניים, המייצגים בעיה רצינית לבריאות האדם וסביבות טבעיות. טיפול בהשפעה של EDCs על תכונות החיים ההורמונליות של הזבוב, כגון פוריות, פוריות, זמן התפתחותי ותוחלת החיים. זוהי דרך קלה, זולה ומהירה לחקור הפרעה אנדוקרינית ב vivo.
הפוריות, ההתפתחות ותוחלת החיים בדרוסופילה יכולים להיות מושפעים ממספר גורמים שיש לשלוט בהם בקפידה כדי להבטיח את התוצאה המוצלחת של פרוטוקול זה. לכן, נדרשת תשומת לב מרבית לגידול וטיפול בזבובים. כדי להתוות את הטעם של EDC שנבחר, לאחר הרדמה, להעביר 15 זבובים צעירים ממיטת הזבוב לארבעה בקבוקונים מקבילים המכילים מדיום קמח תירס מעורבב עם צבעי מזון.
בקבוקון הבקרה מכיל את הממס בלבד, ושלושת הבקבוקונים האחרים מתווספים במינונים שונים של ה- EDCs שנבחרו. שמרו את הבקבוקונים באינקובטור לח ליום אחד עם אור טבעי של 12 שעות. לאחר הרדמה של הזבובים שוב, העבר את הזבובים משותקים לנייר לבן, והצב אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי להתבונן.
השווה את צביעת הבטן של כל קבוצת טיפול ביחס לקבוצת הביקורת. כדי להתבנות את ביצועי הרבייה של הזבובים, להכין שלושה בקבוקונים של זבובים עבור כל EDC כמו בקבוקונים הורים, עם שמונה נקבות וארבעה זכרים ב 10 מיליליטר של מדיום קמח תירס בתוספת EE2. לשליטה, להכין שישה בקבוקונים של זבובים, כל אחד עם שמונה נקבות וארבעה זכרים ב 10 מיליליטר של מזון בינוני קמח תירס בתוספת ממס EE2.
אחורי זבובים באינקובטור ב 25 מעלות צלזיוס. במהלך התפתחותם, הימנע צפיפות הזחלים. לאחר ארבעה ימים, להפוך כל בקבוקון על אתר כדי להסיר את ההורים ולהחזיר את הבקבוקונים לאינקובטור במשך חמישה ימים נוספים.
בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום התשיעי, הפוך כל בקבוקון מעל אתרייזר כדי להסיר את כל הזבובים החדשים שיצאו מהבקבוקונים ולשים את הבקבוקונים באינקובטור אחר ב 18 מעלות צלזיוס לילה. בבוקר יום 10, בתחנת עבודה של דרוסופילה פחמן דו חמצני, בזהירות להפוך את בקבוקון התרבות כדי למנוע זבובים הרדמה ליפול על בינוני ולהכניס צינור גומי עם מחט לתוך הבקבוקון בין פקק הכותנה וקיר הבקבוקון. פתח את השסתום כדי לספק פחמן דו חמצני.
תוך שניות ספורות, העבר את הזבובים למיטת זבוב מתחת למיקרוסקופ. לאסוף נקבות בתולות זכרים צעירים בנפרד לשתי קבוצות על מיטת הזבוב. באופן אקראי subdivide כל קבוצה של זבובים בקבוצות משנה קטנות, עם 10 נקבות או 20 זכרים לכל בקבוקון מלא בינוני קמח תירס מתאים טרי.
המשך הדגירה ולאסוף 30 נקבות בתולות ו 30 זכרים עבור כל EDC, ו 90 נקבות בתולה ו 90 זכרים לשליטה. שכן קבוצות אלה של זבובים ב 25 מעלות צלזיוס עד שהם גיל ארבעה ימים לאחר eclosion. ואז להעביר אותם בקבוקונים חדשים המכילים מדיום מתאים טרי כל יומיים.
בדוק שאין זחלים בבקבוקונים של נקבות. לאחר מכן תייג בקבוקונים עם סדרה שונה של מספרים רציפים לטיפול הבא. לאחר הרדמה, להעביר נקבה אחת EE2 ממיס מטופל לתוך בקבוקון קטן המכיל עגבניות קמח טרי מדיום ללא EE2 ולהוסיף אחד EE2 ממיס מטופלים זכר עבור הפקד על פני.
התאם זכר שטופל ב-EE2 עם נקבה שטופלה בממס EE2 או נקבה שטופלה ב-EE2 עם זכר שטופל בממס EE2 לכל טיפול. בית 20 צלבים בודדים ב-25 מעלות צלזיוס. מעבירים כל זוג הזדווגות לבקבוקונים בינוניים של עגבניות קמח תירס טריות ללא EDC כל יום במשך 10 הימים הבאים.
ויזואלית לבדוק כל בקבוקון כל יום עבור הביצים ולדווח על מספרם על גיליון אלקטרוני פוריות. בכל בקבוקון, בדוק מקרוב אם יש זבובים שזה עתה הופיעו ורשם את המספר היומי של צאצאים בוגרים במהלך 10 הימים. לאחר 10 ימים מההזדווגות הראשונית, יש להסיר את ההורים מסדרת הבקבוקונים האחרונה.
בפרוטוקולים של אקלוזה, ראשית, עבור כל קבוצת טיפול, הקימו 10 בקבוקונים של זבובים צעירים ובריאים בני פחות מיומיים, כל אחד עם שש נקבות ושלושה זכרים ב -10 מיליליטר של מזון קמח תירס ללא EDC. לגדל את הזבובים על מזון במשך 24 שעות ולאפשר להם להזדווג. לאחר מכן להכין עוד 10 בקבוקונים מקבילים לכל קבוצת טיפול עם 10 מיליליטר כל מזון קמח תירס טרי בתוספת ריכוזי EDC שונים או ממס EE2 לבד לבקרה.
העבר את הזבובים ההמומים לבקבוקונים החדשים האלה. הפוך גיליון אלקטרוני התפתחותי כדי להקליט את הסדרות השונות. אפשר לזבובים להטיל ביצים במשך 16 שעות.
לאחר מכן, להסיר את ההורים מן הבקבוקונים. דגירה הבקבוקונים ב 25 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד זחלים נודדים גלויים. בכל יום, לספור את מספר הגלימות החדשות בכל בקבוקון על ידי כתיבת מספר ברצף על ידי כל גולם בצד החיצוני של הבקבוקון, כדי למנוע לספור את אותו גלמה פעמיים.
דווח על מספר הגלם החדש שהתגלה במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד שלא יהיה עוד צורת גלם. החל מהיום התשיעי, לספור את מספר המבוגרים המתעוררים מדי יום, עד לא יותר מבוגרים להגיח. דווח על כך בגיליון האלקטרוני ההתפתחותי ובצע את שאר בדיקת האקלוזה על פי כתב היד.
בפרוטוקול תוחלת החיים, הקימו תחילה 20 בקבוקונים עם שמונה נקבות וארבעה זכרים, שכל אחד מהם מלא ב-10 מיליליטר של מזון קמח תירס ושכן אותם ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר ארבעה ימים, השליכו את הזבובים והחזרו את הבקבוקונים לאנקובטור. בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום התשיעי, הסירו את כל הזבובים החדשים שיצאו מהבקבוקונים והחזירו את הבקבוקונים לאנקובטור.
לאחר 16 עד 24 שעות, מחלקים 250 זבובים בוגרים בני יום אחד משני המינים לארבע קבוצות תחת הרדמה קלה של פחמן דו חמצני ומעבירים אותם לבקבוקים של 250 מיליליטר המכילים מזון בינוני למבוגרים, שלושה בתוספת ריכוזי EDC שונים ואחד עם ממס EE2 בלבד. לשמור על הזבובים ב 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר להם להזדווג. לאחר מכן, מיין כל קבוצה של זבובים לפי מין לשתי קבוצות.
בתוך כל מצב טיפול, עבור שני המינים, באופן אקראי subdivide כל קבוצה לחמישה בקבוקונים מקבילים בצפיפות של 20 אנשים לכל בקבוקון. הכינו גיליון אלקטרוני של תוחלת חיים שבו מספר הזבובים המתים מנוטרל ממספר הזבובים ששרדו מההעברה הקודמת, כך שמספר הניצולים בכל העברה מתקבל באופן אוטומטי. לאחר שלושה ימים, להעביר את הזבובים ללא הרדמה בקבוקונים חדשים המכילים את המזון המתאים באותו זמן ולבדוק את המוות.
רשום את גיל הזבובים ואת מספר הזבובים המתים. חזור על ההעברה כל שלושה ימים עד שכל הזבובים ימותו. בניסוי זה, עקומות תוחלת החיים התווה כמו הישרדות מצטברת לעומת הימים שחלפו עבור כל ריכוז EDC ואת השליטה.
עבור הבקרה, לאחר תקופה ראשונית ארוכה שבה עקומת הניצולים נותרה גבוהה יחסית, היא ירדה באופן אקספוננציאלי לאחר כ-60 יום. בעקבות חשיפת EDC, עקומת הניצול של הזבובים המטופלים הושפעה באופן משמעותי והראתה ירידה דרמטית לאחר 36 ימים. מומלץ על כך בקבוקונים מקבילים תחת ניתוח צריך להיות דומה מאוד, אחרת זה יהיה קשה להבין איזה להשליך.
לכן, אנו ממליצים לנהוג בזהירות רבה, לאמץ תרגול ניסיוני טוב, באמצעות גודל מדגם גדול. בעקבות פרוטוקולים אלה, ניתן גם להעריך את ההשפעה הטרנסג'נדרית של משבש אנדוקריני נבחר, כמו גם לבדוק את ההשפעות התוסף הפוטנציאלי של שילוב של משבשים אנדוקריניים שונים.
