El protocolo representa un paso importante para establecer drosophila como un modelo estándar para las pruebas de seguridad química y para desarrollar nuevas metodologías de enfoque comúnmente llamadas NAMs. El protocolo describe un método eficiente y económico que utiliza medios líquidos para evaluar los efectos tóxicos químicos sobre la viabilidad de la drosophila melanogaster adulta. Comience apilando cuatro hojas de papel de cromatografía de celulosa de grado uno y cortándolas en tiras de dos pulgadas de ancho.
Perfore los insertos de papel de filtro en forma de flor con un punzón de papel de 1,5 pulgadas que contenga un tinte en forma de flor. Empuje la pila de papel de filtro hasta el fondo de un vial de polipropileno de 28,5 milímetros de diámetro utilizando una clavija de madera sin barnizar de 22 por 220 milímetros. Asegúrese de que la pila se encuentra de forma segura en la parte inferior del vial.
Guarde los viales preparados en bandejas de plástico o cartón y coloque las bandejas en bolsas de plástico grandes hasta que las use. Abra el frasco de vidrio que contiene las moscas, colóquelo en la boca del vial de plástico preparado y transfiera las moscas clasificadas al vial de inanición golpeando la parte inferior del vial de plástico contra una mesa de trabajo. Cierre el vial de plástico con un tapón o flug de acetato de celulosa y registre cualquier mosca perdida en esta transferencia.
Marque los viales de inanición que contienen moscas hembras con una raya. Para evitar la mezcla accidental, deje los viales con moscas de correo sin marcar. Prepare la cámara de humedad para la exposición durante la noche colocando seis toallas de papel estándar en la parte inferior.
Luego remoje las toallas de papel con 100 mililitros de agua y coloque la rejilla de plástico sobre las toallas húmedas para asegurarse de que los viales no entren en contacto con las toallas de papel saturadas. Después de colocar las bandejas de los viales de inanición en posición horizontal dentro de la cámara de humedad, transfiera la cámara de humedad a una incubadora de 25 grados centígrados para la incubación durante la noche. Para preparar los viales de exposición química, transfiera cuatro frascos de moscas hembras hambrientas que contengan 20 moscas por vial a cuatro viales de exposición de cada concentración química.
Etiquete estos viales como hembra. Prepare viales de exposición química que contengan colorante azul transfiriendo un frasco de moscas hembras hambrientas a un vial de exposición azul para cada concentración química. Etiquete este vial como hembra.
Registre el número de moscas presentes en cada vial después de la transferencia y anote el número que murió o escapó. Normalmente, las 20 moscas deberían sobrevivir durante la noche a la inanición y la transferencia. Coloque los viales de exposición horizontalmente en una cámara de humedad recién preparada antes de colocar la cámara en una incubadora de 25 grados centígrados con aproximadamente 60% de humedad y un ciclo de luz de 12 es a 12 horas de oscuridad.
Examinar los viales de exposición 24 y 48 horas después del inicio de la exposición química. Cuente y registre las moscas muertas en cada vial en cada punto de tiempo. Para determinar si las moscas expuestas consumieron el medio de exposición azul en los viales de exposición azul después de 24 horas de la exposición química, examine las paredes del vial en busca de las indicaciones de heces azules que aparecen como pequeños puntos en el lado del vial de exposición y el flug.
A continuación, anestesie a las moscas con dióxido de carbono antes de examinar el abdomen para detectar la presencia de tinte azul. Examine las moscas para detectar comportamientos de alimentación anormales, como regurgitación, distensión de cultivos y ruptura de la función de barrera intestinal. Una vez hecho esto, deseche todos los viales contaminados, papel de filtro, tapones y moscas en los contenedores de desechos químicos apropiados.
Si quedan moscas vivas en los viales, congele los viales antes de desecharlos en el contenedor de residuos adecuado. La eficacia del protocolo se determinó exponiendo órganos adultos o moscas macho y hembra al rango de concentraciones de arsonita de sodio de cero a dos milimolares para marcar la letalidad después de 48 horas de exposición. En experimentos posteriores, se seleccionaron concentraciones de cero a cinco milimolares que definieron con mayor precisión la curva de respuesta a la dosis de arsonito de sodio.
Según este modelo, la dosis letal final, o LD 10, LD 25 y LD 50 de moscas macho alimentadas con arsonita de sodio fue de 0,30 milimolar, 0,50 milimolar y 0,65 milimolar respectivamente. Estos valores fueron ligeramente superiores para las moscas hembras con una DL 10 de 0,30 milimolar, una LD 25 de 0,65 milimolar y una LD 50 de 0,90 milimolar. En las moscas macho y hembra alimentadas con 1% F D y C azul que contenían soluciones de arsonita sódica, el alimento ingerido se regurgitó ocasionalmente a dosis superiores a 0,2 milimolares para las hembras y 0,5 milimolares para los machos, lo que sugiere que la regurgitación podría desempeñar un papel clave en la respuesta de la escoria filia al envenenamiento por arsénico.
Siguiendo este protocolo de exposición, las moscas pueden ser recolectadas fácilmente para su posterior análisis, incluidos estudios genómicos y metabolómicos. Este protocolo es el primer paso para establecer la mosca de la fruta drosophila melanogaster como un modelo genético común para realizar estudios a gran escala de toxicología de precisión.
