Die Isolierung der menschlichen Muskelvorläuferzellen, die die Regeneration der Skelettmuskulatur regulieren, ermöglicht es uns, Prozesse zu untersuchen, die dem regenerativen Prozess zugrunde liegen, während die Variabilität der Spender erhalten bleibt. Diese Technik ermöglicht es, große Erträge von menschlichen Muskelvorläuferzellen aus kleinen Mengen von Gewebe und ihre phätotypische Analyse mit einer kleinen Anzahl von Zellen zu erhalten. Diese Methode wurde speziell entwickelt, um menschliche Muskelvorläuferzellen zu isolieren, um ihre Proliferations- und Differenzierungsfähigkeiten zu verfolgen und diese Daten mit dem Regenerationsprozess des Skelettmuskels in Beziehung zu setzen.
Der schwierigste Aspekt dieser recht einfachen Technik ist, sicherzustellen, dass jeder Schritt reproduzierbar durchgeführt wird, um die Ausbeute und Reinheit der Zellen zu optimieren. Es gibt mehrere Schritte, die für eine erfolgreiche Isolierung der Zellen abgeschlossen werden müssen. Einige der Schritte sind leichter zu verstehen, wenn sie visuell beobachtet werden.
Um menschliche Muskelvorläuferzellen aus Biopsiegewebe zu isolieren, legen Sie das Muskelgewebe in eine sterile Petrischale unter sterilen Bedingungen und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um das Gewebe in ein Millimeter gewürfelte Stücke zu zerkleinern. Wenn das gesamte Gewebe gehackt wurde, übertragen Sie die Stücke in eine 15-Milliliter-Röhre mit 10 Milliliter PBS und lassen Sie das Gewebe durch die Schwerkraft absetzen, bevor Sie den Überstand sorgfältig anzapfen, ohne das Gewebe zu stören. Nachdem Sie die Fragmente ein zweites Mal gewaschen haben, wie gerade gezeigt, ersetzen Sie das PBS durch 10 Milliliter des modifizierten Eagle-Mediums dulbecco mit niedrigem Glukoseniveau.
Entfernen Sie den Überstand, nachdem das Gewebe abgelegt wurde, und setzen Sie die Stücke in drei Milliliter Verdauungsmedium wieder aus. Legen Sie das Gewebe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, mit Triturierung der Muskelfragmente alle 10 Minuten mit einer ein Milliliter serologischen Pipette. Am Ende der Inkubation 83 Mikroliter zusätzliches Verdauungsmedium und 24 Mikroliter Dispase-Lösung in die Proben geben und das Gewebe alle fünf bis zehn Minuten mit einer breitbohrenden Pipettenspitze trituieren, bis eine gleichmäßige Gülle erreicht ist.
Eine gleichmäßige Gülle ist wichtig für die maximale Erholung der menschlichen Muskelvorläuferzellen. Setzen Sie die Verdauung fort, wenn die Gülle nicht durch eine Standard-Pipettespitze von 1.000 Mikroliter geht. Um die Pax7-positiven Zellen zu isolieren, färben und torieren Sie die Zellen gemäß dem Protokoll.
Sortieren Sie die CD56, CD29 doppelt positiven menschlichen Muskelvorläuferzellen auf einem Durchflusszytometer mit einer 100-Mikrometer-Düse bei einem Druck von 20 Pfund pro Quadratzoll in Sammelröhrchen, die ein 300-Mikroliter-Kissen fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer summieren. Dann säen Sie die sortierten menschlichen Muskelvorläuferzellen in kollagenbeschichtete 24-Well-Platten, die ein vorgewärmtes Wachstumsmedium bei einer 3,5-mal 10-bis-die vierten Zelle pro Zentimeter quadratinder Konzentration enthalten. Um Zusammenflussscans durchzuführen, laden Sie die Platte auf ein bildgebendes Zytometer, und wählen Sie Neue Scan erstellen und die Plattenkategorie, das Plattenprofil und die Platten-ID.Unter Anwendung wählen Sie Confluence und Confluence 1 aus, und wählen Sie einen Brunnen aus, der angezeigt werden soll.
Suchen Sie eine Fokusebene, in der die Zellen im Vergleich zum Hintergrund weiß erscheinen, und wählen Sie Handbuch registrieren aus. Verwenden Sie die Maus, um alle Bohrungen hervorzuheben, die gescannt werden müssen, und wählen Sie Scan starten aus. Der gesamte Brunnenbereich wird automatisch gescannt.
Wählen Sie die Analyseeinstellungen aus, die für den Platten- und Zelltyp optimal sind, und wählen Sie Analyse starten aus. Verwenden Sie das bildgebende Zytometer, um den Zusammenfluss zunächst zu messen. Um dann die Zellen auf dem bildgebenden Zytometer zu zählen, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch 200 Mikroliter Färbelösung.
Nach 15 Minuten bei 37 Grad Celsius die Färbelösung durch 100 Mikroliter frischen Schinken F12 ersetzen. Geben Sie die Platte an das bildgebende Zytometer zurück, und wählen Sie unter Anwendung Die Option Zelllebensfähigkeit und Live Dead Total aus. Der Live-Kanal wird ein helles Feldbild sein, der Dead-Kanal zeigt die Propidium-Iodid-Färbung und der Total-Kanal wird die Hoechst 33342 Färbung sein.
Klicken Sie unter Fokus-Setup auf Auto registrieren. Legen Sie unter dem Kanal Total den Kanal auf blau fest. Verwenden Sie Fokus suchen, um die Kerne in den Fokus zu rücken, und klicken Sie auf Versatz festlegen, um den Fokus auszuwählen.
Stellen Sie unter dem Kanal "Tote" den Kanal auf Rot ein, und verwenden Sie "Fokus suchen", um die toten Zellen in den Fokus zu rücken. Klicken Sie auf Versatz festlegen, um den Fokus auszuwählen, und wählen Sie Scan starten aus, um den Scan zu starten. Wählen Sie dann die Analyseparameter aus, die für den Platten- und Zelltyp geeignet sind, und wählen Sie Analyse starten aus, um die Analyse zu starten.
Wenn die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie visuell, ob die Analyse die Zellen entsprechend gezählt hat. Wenn der Scan und die Analyse zufriedenstellend sind, geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, andernfalls scannen oder ändern Sie die Analyseparameter. Menschliche Muskelvorläuferzellen können durch erste Gating-Ereignisse identifiziert werden, die auf dem Seiten- und Vorwärtsstreubereich basieren, um abgestorbene Zellen oder Trümmer zu beseitigen, gefolgt von der Auswahl nur der Zellen, die negativ für 7-AAD sind und daher lebensfähig sind.
Die Zellen, die sowohl für CD56- als auch cd29-Zelloberflächenmarker positiv sind, stellen dann die Population der menschlichen Muskelvorläuferzellpopulation dar. Menschliche Muskelvorläuferzellen können auch durch ihre Pax7-Expression identifiziert werden. Tatsächlich ist Pax7 in der Gesamtbevölkerung nach FACS bereichert und wird durch mehrere Passagen aufrechterhalten.
Hier wird ein repräsentativer Zusammenflussscan angezeigt. Die grünen Umrisse wurden durch das bildgebende Zytometer erzeugt und zeigen, wie das bildgebende Zytometer den Zusammenfluss anhand der ausgewählten Analyseeinstellungen bestimmt. Eine Heterogenität und Kernzahl ist zwischen Spendern üblich.
Diese Heterogenität zu entdecken und genau zu charakterisieren, ist eine schlüsselfertige Anwendung des bildgebenden Zytometers. Die Zusammenflussmessungen und Kernzählungen von Einzelspendern sind jedoch stark korreliert. Menschliche Muskelvorläuferzellen, die zu Myoröhren differenziert sind, können durch ihre embryonale Myosin-schwere Kettenexpression unterschieden werden.
Es ist wichtig, bei der Auswahl der Gating-Parameter auf dem Durchflusszytometer konsistent zu sein, um die gleiche Zellpopulation von jedem Spender zu isolieren. Einmal isoliert, menschliche Muskel Vorläuferzellen können für mehrere Zwecke verwendet werden, einschließlich der Identifizierung der einzigartigen metabolischen Anforderungen der Proliferation und Differenzierung der menschlichen Muskel Vorläuferzellen. Die Isolierung menschlicher Muskelvorläuferzellen hat die Diskriminierung der Unterschiede in der Zelloberflächenmarker-Expression auf menschlichen und Mausmuskelvorläuferzellen ermöglicht.
