Isolar as células progenitoras musculares humanas que regulam a regeneração muscular esquelética nos permite investigar processos que fundamentam o processo regenerativo, mantendo a variabilidade do doador. Esta técnica permite que grandes rendimentos de células progenitoras musculares humanas sejam obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido e sua análise fenotípica usando um pequeno número de células. Este método foi especificamente projetado para isolar as células progenitoras musculares humanas para rastrear suas capacidades de proliferação e diferenciação e relacionar esses dados ao processo regenerativo do músculo esquelético.
O aspecto mais difícil desta técnica bastante simples é garantir que cada passo seja realizado de forma reprodutível para otimizar o rendimento e a pureza das células. Existem várias etapas que precisam ser completadas para o isolamento bem sucedido das células. Vários passos são mais fáceis de entender se forem observados visualmente.
Para isolar as células progenitoras musculares humanas do tecido da biópsia, coloque o tecido muscular em uma placa de Petri estéril em condições estéreis, e use um bisturi estéril para picar o tecido em pedaços cubos de um milímetro. Quando todo o tecido tiver sido picado, transfira os pedaços para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de PBS, e permita que os tecidos se assentem pela gravidade antes de aspirar cuidadosamente o supernante sem perturbar o tecido. Depois de lavar os fragmentos uma segunda vez como apenas demonstrado, substitua o PBS por 10 mililitros de baixa glicose dulbecco médio águia modificado.
Remova o supernasciente depois que os tecidos foram instalados, e resuspense os pedaços em três mililitros de meio de digestão. Coloque os tecidos a 37 graus Celsius por 30 minutos, com trituração dos fragmentos musculares a cada 10 minutos com uma pipeta sorológica de um mililitro. Ao final da incubação, adicione 83 microliters de meio de digestão adicional e 24 microliters de solução dispase às amostras, e triturar os tecidos a cada cinco a 10 minutos com uma ponta de pipeta larga até que um chorume uniforme seja alcançado.
Um chorume uniforme é importante para a recuperação máxima das células progenitoras musculares humanas. Continue a digestão se o chorume não passar por uma ponta de pipeta padrão de 1.000 microliter. Para isolar as células Pax7 positivas, colorindo e gate as células de acordo com o protocolo.
Classifique as células progenitoras musculares humanas CD56, CD29 duplamente positivas em um cítmetro de fluxo com um bocal de 100 micrômetros a uma pressão de 20 libras por polegada quadrada em tubos de coleta contendo uma almofada de 300 microliter de tampão de classificação celular ativado pela fluorescência. Em seguida, semeou as células progenitoras musculares humanas classificadas em placas revestidas de colágeno com 24 poços contendo meio de crescimento pré-aquecido a uma concentração quadrada de 3,5 vezes 10 vezes às quatro células por centímetro. Para realizar varreduras de confluência, carregue a placa em um cítmetro de imagem e selecione Criar nova varredura e a categoria da placa, perfil da placa e ID da placa.Sob aplicação, selecione Confluência e Confluência 1 e selecione um poço para visualizar.
Localize um plano de foco no qual as células pareçam brancas em comparação com o plano de fundo e selecione Registrar Manual. Use o mouse para destacar todos os poços que precisam ser digitalizados e selecione Iniciar Varredura. Toda a área do poço será digitalizada automaticamente.
Selecione as configurações de análise ideais para o tipo de placa e célula e selecione Análise inicial. Use o cítmetro de imagem para medir a confluência inicialmente. Em seguida, para contar as células no citômetro de imagem, substitua o meio em cada poço por 200 microliters de solução de coloração.
Após 15 minutos a 37 graus Celsius, substitua a solução de coloração por 100 microliters de F12 fresco de Ham. Retorne a placa ao cítmetro de imagem e, em Aplicação, selecione Viabilidade celular e Total morto vivo. O canal Live será uma imagem de campo brilhante, o canal Dead mostrará a mancha de iodeto de propídio, e o canal Total será a mancha hoechst 33342.
Em Configuração de foco, clique em Registrar auto. Sob o canal Total, defina o canal para azul. Use o Find Focus para colocar os núcleos em foco e clique em Definir Deslocamento para selecionar o foco.
Sob o canal Dead, defina o canal como vermelho, e use Find Focus para colocar as células mortas em foco. Clique em Definir Deslocamento para selecionar o foco e selecione Iniciar varredura para iniciar a varredura. Em seguida, selecione os parâmetros de análise apropriados para o tipo de placa e célula e selecione Iniciar Análise para iniciar a análise.
Quando a análise estiver completa, verifique visualmente se a análise contabilizou adequadamente as células. Se a varredura e a análise forem satisfatórias, devolva a placa à incubadora, caso contrário, rescane ou modifique os parâmetros de análise. As células progenitoras musculares humanas podem ser identificadas por eventos de primeira gating baseados na área de dispersão lateral e para a frente para eliminar células mortas ou detritos, seguidos pela seleção apenas das células que são negativas para 7-AAD e, portanto, são viáveis.
As células positivas para os marcadores de superfície celular CD56 e CD29 representam então a população celular progenitora muscular humana. As células progenitoras musculares humanas também podem ser identificadas por sua expressão Pax7. De fato, pax7 é enriquecido na população total após FACS e é mantido através de múltiplas passagens.
Aqui, uma varredura de confluência representativa é mostrada. Os contornos verdes foram gerados pelo citômetro de imagem e mostram como o cítmetro de imagem determinou a confluência com base nas configurações de análise selecionadas. Uma heterogeneidade e contagem de núcleos é comum entre doadores.
Descobrir e caracterizar com precisão essa heterogeneidade é uma aplicação fundamental do citômetro de imagem. As medidas de confluência e a contagem de núcleos de doadores únicos, no entanto, estão altamente correlacionados. Células progenitoras musculares humanas diferenciadas para formar miotubes podem ser distinguidas por sua expressão embrionária de cadeia pesada de miosina.
É importante ser consistente ao selecionar os parâmetros de gating no citômetro de fluxo, a fim de isolar a mesma população de células de cada doador. Uma vez isoladas, as células progenitoras musculares humanas podem ser usadas para múltiplos propósitos, incluindo a identificação dos requisitos metabólicos únicos de proliferação e diferenciação das células progenitoras musculares humanas. O isolamento das células progenitoras musculares humanas permitiu a discriminação das diferenças na expressão do marcador de superfície celular nas células progenitoras musculares humanas e do camundongo.
