Isoler les cellules progénitrices musculaires humaines qui régulent la régénération musculaire squelettique nous permet d’étudier les processus qui sous-tendent le processus de régénération tout en conservant la variabilité du donneur. Cette technique permet d’obtenir de grands rendements de cellules progénitrices musculaires humaines à partir de petites quantités de tissus et de leur analyse phénotypique à l’aide d’un petit nombre de cellules. Cette méthode est spécifiquement conçue pour isoler les cellules progénitrices musculaires humaines afin de suivre leurs capacités de prolifération et de différenciation et de relier ces données au processus de régénération musculaire squelettique.
L’aspect le plus difficile de cette technique assez simple est de s’assurer que chaque étape est effectuée reproductiblement pour optimiser le rendement et la pureté des cellules. Il y a plusieurs étapes qui doivent être accomplies pour l’isolement réussi des cellules. Plusieurs étapes sont plus faciles à comprendre si elles sont observées visuellement.
Pour isoler les cellules progénitrices musculaires humaines des tissus de biopsie, placez le tissu musculaire dans une boîte de Pétri stérile dans des conditions stériles, et utilisez un scalpel stérile pour hacher le tissu en morceaux en cubes d’un millimètre. Lorsque tout le tissu a été haché, transférer les morceaux dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de PBS, et permettre aux tissus de se déposer par gravité avant d’aspirer soigneusement le supernatant sans déranger le tissu. Après avoir lavé les fragments une deuxième fois comme nous venons de le démontrer, remplacez le PBS par 10 millilitres de milieu Eagle modifié de Dulbecco à faible teneur en glucose.
Enlever le supernatant après que les tissus ont été réglés, et resuspendre les morceaux en trois millilitres de milieu de digestion. Placez les tissus à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, avec trituration des fragments musculaires toutes les 10 minutes avec une pipette sérologique d’un millilitre. À la fin de l’incubation, ajouter 83 microlitres de milieu de digestion supplémentaire et 24 microlitres de solution Dispase aux échantillons, et triturer les tissus toutes les cinq à 10 minutes avec une pointe de pipette à alésage large jusqu’à ce qu’une boue uniforme soit atteinte.
Une boue uniforme est importante pour la récupération maximale des cellules progénitrices musculaires humaines. Continuez la digestion si le lisier ne passe pas par une pointe standard de pipette de 1000 microlitres. Isoler les cellules pax7-positives, tacher et la porte des cellules selon le protocole.
Trier le CD56, CD29 double positif cellules progénitrices musculaires humaines sur un cytomètre d’écoulement avec une buse de 100 micromètres à une pression de 20 livres par pouce carré dans des tubes de collecte contenant un coussin de 300 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence. Puis ensemencer les cellules progénitrices du muscle humain triées en plaques de 24 puits recouvertes de collagène contenant un milieu de croissance préchauffé à une concentration de 3,5 fois 10 à la quatrième cellule par centimètre de concentration carrée. Pour effectuer des analyses de confluence, chargez la plaque sur un cytomètre d’imagerie et sélectionnez Créer un nouveau scan et la catégorie plaque, profil de plaque et application ID.Under de la plaque, sélectionnez Confluence et Confluence 1, et sélectionnez un puits à afficher.
Localisez un plan de mise au point dans lequel les cellules apparaissent blanches par rapport à l’arrière-plan, et sélectionnez Registre Manuel. Utilisez la souris pour mettre en évidence tous les puits qui doivent être scannés et sélectionnez Démarrer l’analyse. Toute la zone du puits sera automatiquement scannée.
Sélectionnez les paramètres d’analyse qui sont optimaux pour le type de plaque et de cellule, et sélectionnez Analyse de démarrage. Utilisez le cytomètre d’imagerie pour mesurer la confluence au départ. Ensuite, pour compter les cellules sur le cytomètre d’imagerie, remplacer le milieu dans chaque puits par 200 microlitres de solution de coloration.
Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, remplacer la solution de coloration par 100 microlitres de F12 de jambon frais. Retournez la plaque au cytomètre d’imagerie, et sous application, sélectionnez Viabilité cellulaire et Live Dead Total. La chaîne Live sera une image à champ lumineux, la chaîne Dead montrera la coloration propidium iodée, et le canal Total sera la coloration Hoechst 33342.
Sous configuration focus, cliquez sur Enregistrer auto. Sous le canal Total, réglez le canal en bleu. Utilisez Find Focus pour mettre les noyaux au point, et cliquez sur Set Offset pour sélectionner la mise au point.
Sous le canal Dead, réglez le canal en rouge et utilisez Find Focus pour mettre les cellules mortes au point. Cliquez sur Définir Offset pour sélectionner la mise au point et sélectionnez Démarrer l’analyse pour démarrer l’analyse. Sélectionnez ensuite les paramètres d’analyse qui conviennent au type de plaque et de cellule, et sélectionnez Démarrer l’analyse pour commencer l’analyse.
Lorsque l’analyse est terminée, vérifiez visuellement que l’analyse a correctement compté les cellules. Si l’analyse et l’analyse sont satisfaisantes, retournez la plaque à l’incubateur, rescan ou modifiez les paramètres d’analyse. Les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent être identifiées par les premiers événements de gating basés sur la zone de dispersion latérale et avant pour éliminer les cellules mortes ou les débris, suivies en sélectionnant seulement les cellules qui sont négatives pour 7-AAD et sont donc viables.
Les cellules qui sont positives pour les marqueurs de surface des cellules CD56 et CD29 représentent alors la population de cellules progénitrices musculaires humaines. Les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent également être identifiées par leur expression Pax7. En effet, Pax7 est enrichi dans la population totale après FACS et est maintenu par de multiples passages.
Ici, un balayage représentatif de confluence est montré. Les contours verts ont été générés par le cytomètre d’imagerie et montrent comment le cytomètre d’imagerie a déterminé la confluence en fonction des paramètres d’analyse sélectionnés. L’hétérogénéité et le dénombrement des noyaux sont fréquents entre les donneurs.
La découverte et la caractérisation précise de cette hétérogénéité est une application clé du cytomètre d’imagerie. Les mesures de confluence et le dénombrement des noyaux des donneurs uniques, cependant, sont fortement corrélés. Les cellules progénitrices musculaires humaines différenciées pour former des myotubes peuvent être distinguées par leur expression embryonnaire de chaîne lourde de myosine.
Il est important d’être cohérent lors de la sélection des paramètres de gating sur le cytomètre d’écoulement afin d’isoler la même population de cellules de chaque donneur. Une fois isolées, les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent être utilisées à des fins multiples, y compris l’identification des exigences métaboliques uniques de prolifération et de différenciation des cellules progénitrices musculaires humaines. L’isolement des cellules progénitrices musculaires humaines a permis de discrimination des différences dans l’expression des marqueurs de surface cellulaire sur les cellules progénitrices musculaires humaines et souris.
