골격 근 재생을 조절 하는 인간의 근육 전구 세포를 격리 하는 우리가 기증자 가변성을 유지 하면서 재생 프로세스의 기초 프로세스를 조사 할 수 있습니다. 이 기술은 소량의 조직과 소수의 세포를 사용하여 그들의 phenotypic 분석에서 얻어지는 인간 근육 전구 세포의 큰 수확량을 허용합니다. 이 방법은 특히 인간의 근육 전구 세포를 분리하여 증식 및 분화 기능을 추적하고 이러한 데이터를 골격 근육 재생 과정에 연관시키도록 설계되었습니다.
이 매우 간단한 기술의 가장 어려운 측면은 모든 단계가 세포의 수율과 순도를 최적화하기 위해 재현적으로 수행되도록하는 것입니다. 셀의 성공적인 격리를 위해 완료해야 하는 여러 단계가 있습니다. 몇 가지 단계는 시각적으로 관찰되었는지 쉽게 이해할 수 있습니다.
생검 조직에서 인간의 근육 전구 세포를 분리하려면 근육 조직을 멸균 조건하에서 멸균 페트리 접시에 넣고 멸균 메스를 사용하여 조직을 1mm 큐브 조각으로 다진다. 모든 조직이 다진 경우, PBS의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 조각을 전송하고, 조직을 방해하지 않고 신중하게 상퍼를 심기 전에 조직이 중력에 의해 정착 할 수 있도록. 방금 입증 된 대로 두 번째로 조각을 세척 한 후 PBS를 저혈당 덜벡코의 수정 된 독수리 매체의 10 밀리리터로 대체하십시오.
조직이 해결된 후 상체를 제거하고 소화 배지의 3 밀리리터로 조각을 다시 중단합니다. 조직을 섭씨 37도에서 30분간, 10분마다 근육 조각을 트리튜레이션하여 1밀리리터 세로지피펫을 장착합니다. 인큐베이션이 끝나면 83마이크로리터의 추가 소화 배지와 24마이크로리터의 디스파스 용액을 샘플에 추가하고, 균일한 슬러리가 이루어질 때까지 와이드 보어 파이펫 팁으로 5~10분마다 조직을 세타게 한다.
균일 한 슬러리는 인간의 근육 전구 세포의 최대 복구에 중요합니다. 슬러리가 표준 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 통과하지 못하면 계속 소화하십시오. Pax7 양성 세포를 격리하려면 프로토콜에 따라 세포를 얼룩및 게이트합니다.
CD56, CD29 이중 양성 인간 근육 전구세포를 100마이크로미터 노즐의 압력으로 100마이크로미터 노즐을 제곱인치당 20파운드의 압력으로 형광 활성화 셀 선별 버퍼의 300마이크로리터 쿠션을 포함하는 수집 튜브로 정렬한다. 그런 다음 정렬된 인간 근육 전구 세포를 3.5배 10에서 제4 세포에 3.5배 10분에서 제곱계 제곱 농도로 미리 데운 성장 배지를 포함하는 콜라겐 코팅 24웰 플레이트로 시드한다. 합류 스캔을 수행하려면 플레이트를 이미징 사이토미터에 로드하고 새 스캔 및 플레이트 범주, 플레이트 프로파일 및 플레이트 ID 를 선택하고 인플루언서 및 인플루언션 1을 선택하고 볼 수 있는 웰을 선택합니다.
셀이 배경에 비해 흰색으로 보이는 초점 평면을 찾아 서설명서 등록을 선택합니다. 마우스를 사용하여 스캔해야 하는 모든 우물을 강조 표시하고 시작 스캔을 선택합니다. 전체 웰 영역이 자동으로 스캔됩니다.
플레이트 및 셀 유형에 최적 분석 설정을 선택하고 시작 분석을 선택합니다. 화상 진찰 세포계를 사용하여 처음에 합류를 측정하십시오. 그런 다음 이미징 세포계에 세포를 계산하려면 각 우물의 배지를 염색 용액 200 마이크로리터로 교체하십시오.
섭씨 37도에서 15분 후, 스테인딩 액액을 신선한 Ham의 F12 100 마이크로리터로 교체하십시오. 플레이트를 이미징 사이토미터로 반환하고 응용 프로그램에서 셀 생존 가능성과 라이브 데드 토탈을 선택합니다. 라이브 채널은 밝은 필드 이미지가 될 것입니다, 죽은 채널은 프로피듐 요오드 스테인링을 표시합니다, 총 채널은 Hoechst 될 것입니다 33342 염색.
포커스 설정에서 자동 등록을 클릭합니다. 총 채널에서 채널을 파란색으로 설정합니다. 포커스 찾기를 사용하여 핵을 포커스로 가져오고 간격띄우기를 클릭하여 포커스를 선택합니다.
데드 채널 에서 채널을 빨간색으로 설정하고 포커스 찾기를 사용하여 죽은 세포를 집중시합니다. 오프셋 설정을 클릭하여 포커스를 선택하고 스캔 시작을 선택하여 검사를 시작합니다. 그런 다음 플레이트 및 셀 유형에 적합한 분석 매개 변수를 선택하고 분석을 시작하도록 선택합니다.
분석이 완료되면 분석이 셀을 적절하게 계산했는지 시각적으로 확인합니다. 스캔 및 분석이 만족스러운 경우 플레이트를 인큐베이터로 반환하거나 분석 매개 변수를 재구성하거나 수정합니다. 인간 근육 전구 세포는 죽은 세포 또는 파편을 제거하기 위하여 측 및 전진 분산 지역에 근거를 둔 첫번째 게이징 사건에 의해 확인될 수 있고, 7-AAD에 대하여 부정적인 세포만을 선택하 및 그러므로 실행 가능합니다.
CD56 및 CD29 세포 표면 마커 모두에 대해 양성 세포는 인간 근육 전구 세포 집단을 나타낸다. 인간 근육 전구 세포는 또한 그들의 Pax7 표현에 의해 확인될 수 있습니다. 실제로 Pax7은 FACS 이후 총 인구가 풍부하며 여러 구절을 통해 유지됩니다.
여기서, 대표적인 합류 스캔이 표시됩니다. 녹색 윤곽선은 이미징 세포계에 의해 생성되었으며 이미징 세포계가 선택한 분석 설정에 따라 인플루엔지를 결정하는 방법을 보여줍니다. 이질성과 핵 수는 기증자 사이에서 일반적입니다.
이 이질성을 발견하고 정확하게 특성화하는 것은 이미징 세포계의 핵심 응용 프로그램입니다. 그러나 독특한 기증자의 합류 측정 및 핵 수는 매우 상관 관계가 있습니다. 심혈관을 형성하기 위해 분화된 인간 근육 전구 세포는 배아 묘신 중형으로 구별될 수 있다.
모든 기증자로부터 동일한 세포 집단을 격리하기 위해 유동 세포계에 게이팅 파라미터를 선택할 때 일관성을 유지해야 합니다. 일단 고립되면, 인간 근육 전구 세포는 인간 근육 전구 세포의 증식 및 분화의 독특한 신진 대사 요구 사항을 식별하는 것을 포함하여 다중 목적을 위해 사용될 수 있습니다. 인간 근육 전구 세포의 격리는 인간및 마우스 근육 전구 세포에 세포 표면 마커 발현의 차이의 차별을 허용하고있다.
