إن عزل خلايا سلف العضلات البشرية التي تنظم تجديد العضلات الهيكلية يسمح لنا بالتحقيق في العمليات التي تقوم عليها عملية التجديد مع الاحتفاظ بتقلبية المتبرع. هذه التقنية تسمح الغلة الكبيرة من الخلايا السلف العضلات البشرية التي يمكن الحصول عليها من كميات صغيرة من الأنسجة وتحليلها phenotypic باستخدام عدد قليل من الخلايا. تم تصميم هذه الطريقة خصيصا لعزل الخلايا السلف العضلات البشرية لتتبع قدراتها على الانتشار والتمايز وربط هذه البيانات لعملية تجديد العضلات الهيكل العظمى.
الجانب الأكثر صعوبة من هذه التقنية مباشرة إلى حد ما هو ضمان تنفيذ كل خطوة بشكل مستنسخ لتحسين العائد والنقاء من الخلايا. هناك عدة خطوات تحتاج إلى إكمالها من أجل عزل الخلايا بنجاح. العديد من الخطوات أسهل في الفهم إذا تمت ملاحظتها بصريًا.
لعزل الخلايا السلف العضلات البشرية من نسيج الخزعة، وضع الأنسجة العضلية في طبق بيتري معقمة في ظل ظروف معقمة، واستخدام مشرط معقمة لتلكم الأنسجة إلى قطع مكعبة ملليمتر واحد. عندما تم مفرم جميع الأنسجة، ونقل القطع إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، والسماح للأنسجة لتسوية الجاذبية قبل التعرق بعناية دون إزعاج الأنسجة. بعد غسل الشظايا للمرة الثانية كما هو موضح للتو ، استبدل برنامج تلفزيوني بـ 10 ملليلتر من متوسطة النسر المعدلة منخفضة الجلوكوز في دولبيككو.
إزالة ناظر بعد أن استقرت الأنسجة، وإعادة تعليق القطع في ثلاثة ملليلتر من وسط الهضم. ضع الأنسجة عند درجة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع تثغر أجزاء العضلات كل 10 دقائق مع ماصات مصلية من ملليلتر واحد. في نهاية الحضانة، إضافة 83 ميكرولترات من متوسط الهضم إضافية و 24 ميكرولترات من محلول ديسباس للعينات، triturate الأنسجة كل خمس إلى 10 دقائق مع طرف ماصة واسعة تتحمل حتى يتحقق الطين موحدة.
الطين موحدة مهم لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من خلايا سلف العضلات البشرية. مواصلة الهضم إذا لم يمر الطين من خلال معيار 1، 000 ميكرولتر ماص تلميح. لعزل الخلايا الإيجابية Pax7، وصمة عار وبوابة الخلايا وفقا للبروتوكول.
فرز CD56, CD29 ضعف إيجابية خلايا سلف العضلات البشرية على مقياس تدفق الخلايا مع فوهة 100 ميكرومتر في ضغط 20 جنيه لكل بوصة مربعة في أنابيب جمع تحتوي على وسادة 300 ميكرولتر من الخلايا المفلورة تنشيط تخزين مؤقت الفرز. ثم بذور الخلايا السلف العضلات البشرية فرزها في الكولاجين المغلفة 24 جيدا لوحات تحتوي على متوسط النمو قبل الدافئة في 3.5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة في تركيز مربع سنتيمتر. لإجراء عمليات المسح، قم بتحميل اللوحة على مقياس ضوئي للتصوير، وحدد إنشاء مسح ضوئي جديد وفئة اللوحة، وملف لوحة التعريف، وتطبيق Plate ID.Under، حدد التقاء والتقاء 1، وحدد بئر للعرض.
حدد موقع مستوى التركيز الذي تظهر فيه الخلايا باللون الأبيض مقارنة بالخلفية، وحدد دليل التسجيل. استخدم الماوس لتسليط الضوء على جميع الآبار التي تحتاج إلى مسح ضوئي، وحدد بدء المسح الضوئي. سيتم فحص منطقة البئر بالكامل تلقائيًا.
حدد إعدادات التحليل الأمثل لنوع اللوحة والخلايا، وحدد بدء التحليل. استخدم مقياس الذوباني للتصوير لقياس الالتقاء في البداية. ثم لحساب الخلايا على جهاز قياس الخلايا التصوير، واستبدال المتوسطة في كل بئر مع 200 ميكرولترات من حل تلطيخ.
بعد 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، واستبدال حل تلطيخ مع 100 ميكرولترات من F12 لحم الخنزير الطازجة. العودة إلى لوحة التصوير cytometer، وتحت التطبيق، حدد الخلية حيوية ويعيش الميت المجموع. وسوف تكون القناة المباشرة صورة حقل مشرق، وسوف تظهر قناة الميت إيوديدوم إيوديدوم تلطيخ، والقناة المجموع سيكون هويشست 33342 تلطيخ.
ضمن "إعداد التركيز"، انقر فوق تسجيل تلقائي. ضمن القناة الإجمالية، قم بتعيين القناة إلى اللون الأزرق. استخدم البحث عن التركيز البؤري لتركيز البؤرة النووية، ثم انقر على تعيين الإزاحة لتحديد التركيز.
تحت قناة الميت، تعيين القناة إلى الأحمر، واستخدام البحث عن التركيز على جعل الخلايا الميتة في التركيز. انقر فوق تعيين إزاحة لتحديد التركيز، وحدد بدء المسح الضوئي لبدء الفحص. ثم حدد معلمات التحليل المناسبة لنوع اللوحة و الخلية، ثم حدد بدء التحليل لبدء التحليل.
عند اكتمال التحليل، تحقق بصرياً من أن التحليل حسب الخلايا بشكل مناسب. إذا كان الفحص والتحليل مرضيين، قم بإرجاع اللوحة إلى الحاضنة، وإلا قم بإعادة مسح أو تعديل معلمات التحليل. يمكن تحديد خلايا السلف العضلات البشرية من قبل الأحداث الأولى الغاتينغ على أساس الجانب وإلى الأمام منطقة التشتت للقضاء على الخلايا الميتة أو الحطام، تليها اختيار الخلايا التي هي سلبية فقط ل7-AAD وبالتالي قابلة للحياة.
الخلايا التي هي إيجابية لكل من علامات سطح الخلية CD56 وD29 ثم تمثل مجموعة الخلايا السلف العضلات البشرية. يمكن أيضا أن تكون خلايا السلف العضلات البشرية التي تم تحديدها من خلال التعبير Pax7 بهم. والواقع أن عملية "باكس 7" تُثري في مجموع السكان بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية ويتم الحفاظ عليها من خلال عدة ممرات.
هنا، يتم عرض مسح التقاء تمثيلي. تم إنشاء الخطوط العريضة الخضراء بواسطة مقياس الصور واظهار كيف حدد مقياس الصور الالتقاء بناءً على إعدادات التحليل المحددة. ومن الشائع أن يكون هناك تغايرية وعدد النوى بين المانحين.
اكتشاف وتتميز بدقة هذا التغاير هو تطبيق رئيسي لمقياس الصور. غير أن قياسات الالتقاء وعدد النوى من المانحين الفريدين مترابطان إلى حد كبير. يمكن تمييز الخلايا السلف العضلات البشرية التي تختلف لتشكيل myotubes من خلال التعبير سلسلة الميوسين الجنينية الثقيلة.
من المهم أن تكون متسقة عند اختيار المعلمات الغات على تدفق سايتوميمتر من أجل عزل نفس السكان من الخلايا من كل متبرع. مرة واحدة معزولة, يمكن استخدام خلايا السلف العضلات البشرية لأغراض متعددة, بما في ذلك تحديد متطلبات التمثيل الغذائي فريدة من الانتشار والتمايز من خلايا سلف العضلات البشرية. وقد سمحت عزلة الخلايا السلف العضلات البشرية التمييز من الاختلافات في التعبير علامة سطح الخلية على خلايا السلف العضلات الإنسان والفأر.
