Изоляция клеток-предшественников мышц человека, которые регулируют регенерацию скелетных мышц, позволяет исследовать процессы, которые лежат в основе регенеративного процесса при сохранении изменчивости донора. Этот метод позволяет получить большие урожаи клеток-предшественников мышц человека из небольшого количества тканей и их фенотипического анализа с использованием небольшого количества клеток. Этот метод специально разработан, чтобы изолировать клетки-предшественники мышц человека, чтобы отслеживать их пролиферацию и дифференциацию возможностей и соотнести эти данные с регенеративным процессом скелетных мышц.
Самым сложным аспектом этого довольно простого метода является обеспечение того, чтобы каждый шаг выполнялся воспроизводимо для оптимизации урожайности и чистоты клеток. Есть несколько шагов, которые должны быть завершены для успешной изоляции клеток. Некоторые из шагов легче понять, если они наблюдаются визуально.
Чтобы изолировать клетки-предшественники мышц человека от биопсии ткани, поместите мышечную ткань в стерильную чашку Петри в стерильных условиях, и использовать стерильный скальпель, чтобы фарш ткани на один миллиметр кубированных частей. Когда все ткани были измельчены, передать куски в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров PBS, и позволить тканям осесть под действием силы тяжести, прежде чем тщательно аспирировать супернатант, не нарушая ткани. После мытья фрагментов во второй раз, как только что продемонстрировано, заменить PBS с 10 миллилитров низко глюкозы Dulbecco модифицированных Eagle среды.
Удалите супернатант после того, как ткани были урегулированы, и повторно поместить куски в три миллилитров пищеварения среды. Поместите ткани при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, с тритурацией фрагментов мышц каждые 10 минут с одноми миллилитровой серологической пипеткой. В конце инкубации добавьте 83 микролитров дополнительной среды пищеварения и 24 микролитров раствора dispase в образцы и тритурировать ткани каждые пять-десять минут с широкой наконечником пипетки до тех пор, пока не будет достигнута однородная суспензия.
Однородная суспензия важна для максимального восстановления клеток-предшественников мышц человека. Продолжить пищеварение, если суспензия не проходит через стандартный 1000-микролитровый наконечник пипетки. Изолировать Pax7-положительные клетки, пятно и ворота клеток в соответствии с протоколом.
Сортировать CD56, CD29 двойной положительный человеческий мышцы прародителя клеток на поток цитометра с 100-микрометровой сопла под давлением 20 фунтов на квадратный дюйм в сбор труб, содержащих 300-микролитровую подушку флуоресценции активированных клеток сортировки буфера. Затем семя отсортированы человеческие клетки-предшественник мышцы в коллагена покрытием 24-хорошо пластин, содержащих предварительно разогретой среды роста в 3,5 раза от 10 до четвертой клетки на сантиметр квадратной концентрации. Для выполнения сканирования слияния загрузите пластину на цитометр изображения и выберите «Создайте новое сканирование и категорию плит, профиль плиты» и приложение Плиты ID.Under Application, выберите Confluence и Confluence 1 и выберите колодец для просмотра.
Найдите плоскость фокусировки, в которой ячейки выглядят белыми по сравнению с фоном, и выберите Руководство по регистру. Используйте мышь, чтобы выделить все скважины, которые должны быть отсканированы, и выберите Start Scan. Вся зона хорошо будет автоматически отсканирована.
Выберите параметры анализа, оптимальные для типа пластины и ячейки, и выберите стартовый анализ. Используйте цитометр изображения для измерения слияния на начальном этапе. Затем, чтобы подсчитать клетки на цитометре изображения, замените среду в каждой колодец 200 микролитров окрашивания раствора.
Через 15 минут при 37 градусах по Цельсию замените окрашивающий раствор 100 микролитров свежего ветчины F12. Верните пластину в цитометр изображения, и в соответствии с приложением, выберите жизнеспособность клеток и Live Dead Total. Канал Live будет ярким полем изображения, мертвый канал покажет окрашивание йодида пропидия, а канал Total будет окрашивать Hoechst 33342.
В рамках настройки фокусировки щелкните Register Auto. Под каналом Total установите канал на синий. Используйте Find Focus, чтобы привлечь ядра в фокус, и нажмите Set Offset, чтобы выбрать фокус.
Под мертвым каналом установите канал на красный цвет и используйте Find Focus, чтобы привлечь внимание мертвых клеток. Нажмите Set Offset, чтобы выбрать фокус, и выберите Start Scan, чтобы начать сканирование. Затем выберите параметры анализа, подходящие для типа пластины и ячейки, и выберите стартовый анализ для начала анализа.
Когда анализ завершен, визуально убедитесь, что анализ надлежащим образом подсчитал клетки. Если сканирование и анализ являются удовлетворительными, верните пластину в инкубатор, в противном случае пересканировать или изменить параметры анализа. Клетки-предшественники мышц человека могут быть идентифицированы с помощью первых событий, основанных на боковой и форвардной области рассеяния для устранения мертвых клеток или мусора, а затем выбрать только клетки, которые являются отрицательными для 7-AAD и, следовательно, являются жизнеспособными.
Клетки, которые являются положительными для CD56 и CD29 маркеров поверхности клеток, то представляют человека мышечной популяции клеток-предшественников. Клетки-предшественники мышц человека также могут быть идентифицированы по выражению Pax7. Действительно, Pax7 обогащается в общей численности населения после FACS и поддерживается через несколько проходов.
Здесь отображается репрезентативное сканирование слияния. Зеленые очертания были сгенерированы цитометром изображения и показывают, как цитометр изображения определял слияние на основе выбранных параметров анализа. Неоднородность и количество ядер является общим между донорами.
Обнаружение и точное характеристика этой неоднородности является ключевым применением цитометра изображений. Однако измерения слияния и количество ядер от уникальных доноров в значительной степени коррелируют друг с тем. Клетки-предшественники мышц человека, дифференцированные по форме миотрубов, можно отличить по их эмбриональному выражению тяжелой цепи миозин.
Важно быть последовательным при выборе параметров gating на цитометре потока, чтобы изолировать ту же популяцию клеток от каждого донора. После изоляции клетки-предшественники мышц человека могут быть использованы для различных целей, включая выявление уникальных метаболических требований к пролиферации и дифференциации клеток-предшественников мышц человека. Изоляция клеток-предшественников мышц человека позволила различий в выражении маркера поверхности клетки на клетках-предшественниках мышц человека и мыши.
