Este método crea un paradigma para futuros estudios proporcionando a los investigadores un modelo fiable y traslacional de conmoción cerebral que permite la caracterización longitudinal de los efectos moleculares de la conmoción cerebral. Este modelo de rata combina la microdiálisis permitiendo la cuantificación continua de los analitos con una técnica de envoltura de cuña que ejerce una rápida aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso que imita una característica esencial del trauma craneocerebral humano. La implicación de esta técnica se extiende hacia estudios terapéuticos de conmoción cerebral, ya que ofrece una valiosa oportunidad para estudiar el mecanismo y la eficacia de los agentes farmacológicos in vivo e ininterrumpidamente.
Se recomienda trabajar en equipos de dos durante los pasos de conmoción cerebral e inducción falsa de este método para restringir los errores de manipulación y maximizar la eficiencia durante el experimento. Demostrando el procedimiento estará Chloe Provost, una técnico en nuestro laboratorio. Para comenzar el procedimiento, afeite la cabeza del animal con un cortador eléctrico.
Limpie la zona afeitada con una solución de 2%alcohol isopropílico y 2%gluconato de clorhexidina tres veces. Luego aplique un ung ón lubricante para prevenir la sequedad durante la anestesia. A continuación, coloque la rata en un aparato estereotaxico.
Inserte las barras de los oídos en los conductos auditivos con mucho cuidado y apriete la abrazadera de la nariz. Después, fije una cánula guía de acero inoxidable de calibre 26 al brazo del soporte en el aparato estereotaxico. Haga una incisión de línea media de tres centímetros en el cuero cabelludo.
Deje el cráneo despejado instalando cuatro abrazaderas alrededor de la incisión. Raspa el periosteum firmemente del cráneo con la hoja quirúrgica hasta que las suturas de bregma y lambda sean visibles. Si hay sangrado, mantenga una presión firme sobre el cráneo con una almohadilla de gasa o un aplicador con punta de algodón.
Confirme si el cráneo está correctamente alineado en el aparato estereotaxico comparando las coordenadas dorsoventrales del bregma y las suturas lambda. Identifique las coordenadas anteroposterior, mediolateral y dorsoventral de la sutura de bregma como puntos de referencia para las coordenadas de la cánula guía. A continuación, tomando las coordenadas de la sutura de bregma como referencias, calcular las coordenadas del sitio de implantación de la cánula guía en el hipocampo.
Marque el sitio de implantación preciso utilizando un marcador. Posteriormente, taladre un agujero con un diámetro de 0,5 milímetros a través del cráneo en el sitio objetivo de la cánula guía. Taladre otros tres agujeros aproximadamente cinco milímetros alrededor de este punto para enhebrar tres tornillos de anclaje en el cráneo que solidificarán la cánula después de aplicar cemento dental acrílico.
A continuación, inserte la cánula en el hipocampo y fíjela con cemento dental. Tenga cuidado de no derramar el exceso de cemento dental alrededor del sitio donde se caerá el peso. Deje que el cemento se seque durante dos minutos y luego retire el brazo del soporte de la cánula.
Inserte un obturador extraíble de acero inoxidable en la cánula para evitar la filtración del líquido cefalorraquídeo y los riesgos de infección. Después, retire las cuatro abrazaderas, tire hacia atrás de la piel retraída y cosúlela con un hilo de sutura quirúrgica. A continuación, retire la rata del aparato e inyecte Buprenorfina por vía subcutánea para tratar el dolor.
Coloque el roedor de nuevo en su jaula con una almohadilla de calentamiento debajo hasta que se vuelva consciente. Luego devuélvelo al centro de cuidado de animales para un período de recuperación de siete días bajo estrecha vigilancia. En este procedimiento, retire el obturador de la cánula e inserte lentamente una sonda de microdiálisis.
A continuación, fije el conjunto de la sonda a un resorte de acero inoxidable atado a un brazo de palanca de contrapeso y giro líquido con un soporte de anillo y abrazaderas para que el animal pueda moverse libremente dentro de su jaula. Las ratas atadas tienen acceso ad libitum a alimentos y agua durante todo el procedimiento de microdiálisis. Utilice una bomba de microinfusión para entregar perfusión a la sonda y recoger el dializato de la línea de salida de sílice fusionada.
Al menos una hora y 30 minutos antes de que comience el procedimiento, sume la sonda a su caudal de trabajo a un microlitro por minuto. Compruebe que el caudal de la sonda es constante midiendo el volumen a lo largo del tiempo con una pipeta. Después, recoja cada muestra de dializado en un vial de fracción precargado con un microlitro de 0,25 mole por litro de ácido perclórico para evitar la degradación del analito.
Almacene la muestra a cuatro grados centígrados para su posterior análisis. Una vez recogida la última muestra, retire la sonda de microdiálisis de la cánula y vuelva a insertar el obturador antes de devolver la rata al centro de cuidado de animales. Para instalar el aparato de conmoción cerebral, pegue una lámina de aluminio firmemente en un marco de plexiglás en forma de U que contenga un cojín de espuma.
Utilice una cuchilla de afeitar afilada para hacer ranuras en la hoja de aluminio. Pegue la lámina de aluminio ranurado. A continuación, coloque el marco de plexiglás debajo de un tubo guía de PVC.
Sujete el tubo guía de PVC en su lugar con un soporte de abrazadera a 3-1/2 centímetros por encima del aluminio ranurado. Fije una línea de pesca con mosca de nylon a través del lazo metálico para que la parte inferior del peso esté a 2-1/2 centímetros sobre el aluminio ranurado para evitar múltiples golpes cuando la rata está cayendo sobre el cojín de espuma después del impacto. A continuación, fije la línea de pesca con mosca de nylon al soporte de la abrazadera.
Tire hacia arriba el peso a través del tubo de PVC con la línea de pesca con mosca de nylon. Manténgalo en su lugar insertando una llave hexagonal a través de los orificios perforados preliminares a un metro por encima de la lámina de aluminio ranurado. Para inducir la conmoción cerebral, coloque el animal en su pecho sobre la hoja de aluminio ranurado para que su cabeza se coloque directamente en el camino del peso de latón.
Retire el cono de la nariz y tire de la llave hexagonal. El peso caerá verticalmente a través del tubo de PVC e impactará la cabeza de la rata. Como resultado, la rata sufrirá una rápida rotación de 180 grados y aterrizará sobre su espalda.
Retire la rata del cojín de espuma y colóquela sobre su espalda en la jaula. Utilice un temporizador digital para medir el tiempo de reflejo de corrector como un signo de recuperación y gravedad de la lesión. El tiempo reflejo de derecha es el tiempo total desde el impacto hasta que la rata se despierta y espontáneamente vuelve a la posición propensa o comienza a caminar.
Tenga en cuenta cualquier signo de muerte, fractura o sangrado. Para una inducción falsa, coloque el animal en su pecho sobre la hoja de aluminio ranurado para que su cabeza quede directamente en el camino del peso de latón. Retire el cono de la nariz y luego retire el animal de la hoja de aluminio sin tirar de la llave hexagonal.
Después, coloque la rata sobre su espalda en la jaula. Utilice un temporizador digital para medir el tiempo de correctación como un indicador de la restauración neurológica. Los animales del grupo lesionado tuvieron un tiempo de enomado significativamente mayor en promedio en comparación con los casos falsos y aparecieron aturdidos al recuperar la conciencia.
De los 10 casos del grupo de conmoción cerebral, sólo un animal mostró signos menores de sangrado debajo del lugar del impacto después de la caída de peso. Se observaron aumentos significativos en las concentraciones extracelulares de glutamato en la región ca1 del hipocampo durante los primeros 10 minutos después de la inducción del trauma en comparación con una lesión falsa. Recuerde durante la inducción de la conmoción evitar afectar la cánula con el peso, ya que esto generaría lesiones en el núcleo de la rata que son significativamente más graves que una conmoción cerebral.
Este método se puede aplicar al estudio de conmociones cerebrales repetidas ya que el procedimiento es una lesión en la cabeza cercana que se puede repetir en los mismos animales en diferentes puntos de tiempo.
