Cette méthode crée un paradigme pour les études futures en fournissant aux chercheurs un modèle fiable et translationnel de commotion cérébrale qui permet la caractérisation longitudinale des effets moléculaires des commotions cérébrales. Ce modèle de rat combine la microdialyse permettant la quantification continue d’analyte avec une technique d’enveloppement de coin exerçant l’accélération et la décélération rapides de la tête et du torse qui imite une caractéristique essentielle du trauma craniocerebral humain. L’implication de cette technique s’étend aux études thérapeutiques de commotion cérébrale car elle offre une occasion valable d’étudier le mécanisme et l’efficacité des agents pharmacologiques in vivo et ininterrompus.
Il est fortement recommandé de travailler en équipe de deux pendant les étapes de commotion cérébrale et d’induction simulée de cette méthode pour limiter les erreurs de manipulation et maximiser l’efficacité pendant l’expérience. Chloé Provost, technicienne dans notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer l’intervention, rasez la tête de l’animal à l’aide d’une tondeuse électrique.
Nettoyez la zone rasée à l’aide d’une solution de 2% d’alcool d’isopropylique et 2% de chlorhexidine gluconate trois fois. Appliquez ensuite de l’onguent lubrifiant pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie. Ensuite, placez le rat dans un appareil stéréotaxique.
Insérez les barres d’oreille dans les conduits auditifs avec grand soin et serrez la pince avant. Par la suite, fixez une canule guide en acier inoxydable de calibre 26 vers le bras du support de l’appareil stéréotaxique. Faire une incision de milieu de ligne de trois centimètres sur le cuir chevelu.
Laissez le crâne clair en installant quatre pinces autour de l’incision. Grattez fermement le périoste du crâne avec la lame chirurgicale jusqu’à ce que les sutures de bregma et lambda soient visibles. S’il y a saignement, maintenez la pression ferme sur le crâne avec un tampon de gaze ou un applicateur à pointe de coton.
Confirmez si le crâne est correctement aligné sur l’appareil stéréotaxique en comparant les coordonnées dorsoventrales des sutures bregma et lambda. Identifiez les coordonnées anteroposterior, mediolateral et dorsoventrale de la suture de bregma comme points de référence pour les coordonnées de la canule guide. Puis en prenant les coordonnées de suture bregma comme références, calculer les coordonnées du site d’implantation de canule guide dans l’hippocampe.
Marquez le site d’implantation précis à l’aide d’un marqueur. Par la suite, percer un trou d’un diamètre de 0,5 millimètre à travers le crâne à l’emplacement cible de la canule guide. Percer trois autres trous d’environ cinq millimètres autour de ce point pour enfiler trois vis d’ancrage dans le crâne qui solidifiera la canule après l’application de ciment dentaire acrylique.
Ensuite, insérez la canule dans l’hippocampe et fixez-la avec du ciment dentaire. Veillez à ne pas renverser l’excès de ciment dentaire autour du site où le poids sera laissé tomber. Laisser sécher le ciment pendant deux minutes, puis retirer le bras du support de la canule.
Insérez un obturateur amovible en acier inoxydable dans la canule pour éviter l’infiltration du liquide céphalo-rachidien et les risques d’infection. Ensuite, retirez les quatre pinces, retirez la peau rétractée et cousez-la avec un fil de suture chirurgicale. Ensuite, retirez le rat de l’appareil et injectez de la buprénorphine sous-cutanée pour traiter la douleur.
Remettre le rongeur dans sa cage avec un coussin chauffant en dessous jusqu’à ce qu’il devienne conscient. Retournez-le ensuite à l’établissement de soins aux animaux pour une période de rétablissement de sept jours sous étroite surveillance. Dans cette procédure, retirez l’obturateur de la canule et insérez lentement une sonde de microdialyse.
Ensuite, fixez l’assemblage de la sonde à un ressort en acier inoxydable attaché à un bras de levier pivotant et de contrepoids liquide avec un support d’anneau et des pinces afin que l’animal puisse se déplacer librement dans sa cage. Les rats attachés ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la procédure de microdialyse. Utilisez une pompe à microinfusion pour livrer du perfusate à la sonde et recueillir le dialyse de la ligne de sortie de silice fusionnée.
Au moins une heure et 30 minutes avant le début de la procédure, montez la sonde à son débit de travail à un microlitre par minute. Vérifiez que le débit de la sonde est constant en mesurant le volume au fil du temps à l’l’insurité d’une pipette. Ensuite, recueillir chaque échantillon de dialyse dans une fraction de flacon préchargé avec un microlitre de 0,25 grain de beauté par litre d’acide perchlorique pour prévenir la dégradation de l’analyte.
Stockez l’échantillon à quatre degrés Celsius pour analyse ultérieure. Une fois le dernier échantillon prélevé, retirer la sonde de microdialyse de la canule et réinsérer l’obturateur avant de retourner le rat à l’établissement de soins aux animaux. Pour installer l’appareil de commotion cérébrale, collez fermement une feuille d’aluminium à un cadre en plexiglas en forme de U qui contient un coussin en mousse.
Utilisez une lame de rasoir tranchante pour faire des fentes dans la feuille d’aluminium. Collez la feuille d’aluminium fendtée. Placez ensuite le cadre en plexiglas sous un tube de guidage en PVC.
Maintenez le tube de guidage en PVC en place avec un support de pince à 3-1/2 centimètres au-dessus de l’aluminium fendté. Fixez une ligne de pêche à la mouche en nylon à travers la boucle métallique de sorte que le fond du poids est à 2-1/2 centimètres au-dessus de l’aluminium fendté pour éviter de multiples coups lorsque le rat tombe sur le coussin de mousse après l’impact. Attachez ensuite la ligne de pêche à la mouche en nylon au support à pinces.
Tirez le poids à travers le tube de PVC avec la ligne de pêche à la mouche en nylon. Gardez-le en place en insérant une clé d’hex à travers les trous forés préliminaires à un mètre au-dessus de la feuille d’aluminium fendée. Pour induire une commotion cérébrale, placez l’animal sur sa poitrine sur la feuille d’aluminium fendtée de sorte que sa tête soit placée directement sur le chemin du poids en laiton.
Retirez le cône avant et tirez la touche hex. Le poids tombera verticalement à travers le tube de PVC et aura un impact sur la tête du rat. En conséquence, le rat subira une rotation rapide de 180 degrés et atterrira sur son dos.
Retirez le rat du coussin en mousse et placez-le sur le dos dans la cage. Utilisez une insurité numérique pour mesurer le temps réflexe de redressement comme un signe de récupération et de gravité des blessures. Le temps réflexe de droitage est le temps total de l’impact jusqu’à ce que le rat se réveille et se retourne spontanément vers la position couchée ou commence à marcher.
Notez tout signe de décès, de fracture ou de saignement. Pour l’induction simulée, placez l’animal sur sa poitrine sur la feuille d’aluminium fendtée de sorte que sa tête se pose directement sur le chemin du poids en laiton. Retirez le cône avant, puis retirez l’animal de la feuille d’aluminium sans tirer la clé hex.
Ensuite, placez le rat sur son dos dans la cage. Utilisez une mise à l’heure numérique pour mesurer le temps de droitage comme indicateur de restauration neurologique. Les animaux du groupe blessé ont eu un temps de droitage sensiblement augmenté en moyenne par rapport aux cas simulés et sont apparus stupéfaits en regagnant conscience.
Sur les 10 cas du groupe commotion cérébrale, un seul animal présentait des signes mineurs de saignement sous le site de l’impact à la suite de la baisse de poids. Des augmentations significatives des concentrations extracellulaires de glutamate ont été observées dans la région hippocampal de CA1 pendant les 10 premières minutes suivant l’induction de trauma comparée aux dommages simulés. S’il vous plaît rappelez-vous pendant l’induction commotion éviter d’avoir un impact sur la canule avec le poids que cela générerait des blessures au noyau du rat qui sont significativement plus graves qu’une commotion cérébrale.
Cette méthode peut être appliquée à l’étude des commotions cérébrales répétées puisque la procédure est une blessure à la tête étroite qui peut être répétée sur les mêmes animaux à différents moments.
