この方法は、脳震盪の分子効果の縦方向の特徴付けを可能にする脳震盪の信頼性の高い翻訳モデルを研究者に提供することにより、将来の研究のためのパラダイムを作成します。このラットモデルは、ヒト頭蓋脳外傷の本質的な特徴を模倣する頭部および胴体の急速な加速および減速を発揮するウェッジラップ技術と連続的な分析を可能にするマイクロダイアルディスを組み合わせた。この技術の意味は、生体内および中断のない薬理学的薬剤のメカニズムおよび有効性を研究する貴重な機会を提供するので、脳震盪の治療研究にまで及ぶ。
この方法の脳震盪とシャム誘導ステップの間に2人のチームで作業し、操作エラーを制限し、実験中の効率を最大化することを強くお勧めします。手順を実証することは、私たちの研究室の技術者であるクロエ・プロボストです。手順を開始するには、電気クリッパーを使用して動物の頭を剃ります。
2%イソプロピルアルコールと2%クロルヘキシジングルコン酸の溶液を使用して剃った領域を3回洗浄します。次に、麻酔中の乾燥を防ぐために潤滑眼軟膏を塗布する。次に、ラットを立体的な装置に入れる。
耳の棒を細心の注意を払って外耳道に入れ、鼻クランプを締めます。その後、ステレオタックス装置のホルダーアームに26ゲージのステンレススチールガイドカニューレを固定します。頭皮に3センチメートルの中線切開を行います。
切開の周りに4つのクランプを取り付けることによって、頭蓋骨をクリアにしておきます。ブレグマとラムダ縫合糸が見えるまで、外科用ブレードで頭蓋骨から骨膜をしっかりと削ります。出血がある場合は、ガーゼパッドまたは綿の先端のアプリケーターで頭蓋骨にしっかりとした圧力を維持します。
頭蓋骨が、ブレグマとラムダ縫合のドーソベントラ座標を比較して、ステレオタックス装置上で正しく整列しているかどうかを確認します。ガイドカニューレの座標の基準点として、ブレグマ縫合線の後側、平凡、およびドーソベンタル座標を識別します。次に、ブレグマ縫合線座標を参照として取り、海馬におけるガイドカニューレ注入部位の座標を計算する。
マーカーを使用して正確な移植部位をマークします。その後、ガイドカニューレの標的部位で、直径0.5ミリメートルの穴を、頭蓋骨を通して穴を開けます。この点の周りに約5ミリメートルの他の3つの穴を開けて、アクリル歯科セメントを塗布した後にカニューレを固める3本のアンカーネジを頭蓋骨に通します。
次に、カニューレを海馬に挿入し、歯科用セメントで固定します。重量が落とされる場所の周りに余分な歯科用セメントをこぼさないように注意してください。セメントを2分間乾燥させ、カニューレからホルダーアームを取り外します。
脳脊髄液の浸透や感染のリスクを避けるために、ステンレス鋼の取り外し可能な眼停止剤をカニューレに挿入します。その後、4つのクランプを取り外し、引き込まれた皮膚を引き戻し、外科用縫合糸で縫い付けます。次に、装置からラットを取り出し、ブプレノルフィンを皮下注射して痛みを治療する。
げっ歯類を、意識が高まるまで、暖房パッドを下に置いてケージに戻します。その後、綿密な監視の下で7日間の回復期間のために動物のケア施設に戻します。この手順では、カニューレからオブチュレーターを取り外し、マイクロ透析プローブをゆっくりと挿入します。
次に、プローブアセンブリを液体スイベルにつながれたステンレス製のスプリングに固定し、リングスタンドとクランプでレバーアームをカウンターバランスし、動物がケージ内を自由に動かすことができるようにします。つながれたラットは、ミクロ透析手順全体の間に食物および水へのアドリビタムアクセスを有する。マイクロインフュージョンポンプを使用して、プローブに透水を送り、融合したシリカ出口線から透析液を回収します。
処置が始まる少なくとも1時間30分前に、プローブを1分あたり1マイクロリットルで動作流量に上げる。ピペットで時間の経過に伴う体積を測定することにより、プローブの流量が一貫していることを確認します。その後、各透析液サンプルを、1リットル当たり0.25モルの過塩素酸をプリロードした分数バイアルに集め、検体の分解を防ぎます。
その後の分析のために、サンプルを摂氏4度で保存します。最後のサンプルを採取したら、カニューレからマイクロ透析プローブを取り出し、検査器を再挿入してからラットを動物のケア施設に戻します。脳震盪装置を取り付けるには、フォームクッションを含むU字型プレキシガラスフレームにアルミニウムシートをしっかりとテープで貼ります。
鋭利なカミソリの刃を使用して、アルミニウムシートにスリットを作ります。スロット付きアルミニウムシートをテープで貼ります。次に、ビキシガラスフレームをPVCガイドチューブの下に配置します。
PVCガイドチューブを、スロット付きアルミニウムの3〜1/2センチメートル上のクランプスタンドで所定の位置に保持します。重量の底がスロットアルミニウムの上に2-1/2センチメートルになるように、金属ループを通してナイロンフライフィッシングラインを取り付け、ラットが衝撃の後に泡クッションに落ちているときに複数のヒットを防ぎます。次に、ナイロンフライフィッシングラインをクランプスタンドに取り付けます。
ナイロンフライ釣り糸でPVCチューブを通して重量を引き上げる。スロット付きアルミホイルの1メートル上に予備的な穴を通して六角キーを挿入することによって、それを所定の位置に保ちます。脳震盪を誘発するには、その頭が真鍮の重量のパスに直接配置されるように、スロット付きアルミニウムシートの胸の上に動物を置きます。
ノーズコーンを取り外し、16進数キーを引っ張ります。重量はPVCチューブを通して垂直に落ち、ラットの頭部に影響を与えます。その結果、ラットは急速に180度回転し、背中に着陸します。
泡クッションからラットを取り出し、ケージの背面に置きます。回復と怪我の重症度の兆候として、適切な反射時間を測定するためにデジタルタイマーを使用します。右反射時間は、ラットが目を覚まし、自発的に起こりやすい位置に戻るか、歩き始めるまでの衝撃からの合計時間です。
死亡、骨折、出血の兆候に注意してください。シャム誘導のために、その頭が真鍮の重量のパスに直接横たわるように、スロット付きアルミニウムシートの上に胸の上に動物を置きます。ノーズコーンを取り外し、六角キーを引っ張らずにアルミシートから動物を取り除きます。
その後、ケージの中でネズミを背中に置きます。神経学的回復の指標として、適切な時間を測定するためにデジタルタイマーを使用してください。負傷したグループの動物は、平均対恥のケースで有意に正しい時間を増加させ、意識を取り戻すと驚いたように見えました。
脳震盪群の10例のうち、体重減少後の衝撃部位の下で軽度の出血徴候を示した動物は1匹だけだった。細胞外グルタミン酸濃度の有意な増加は、恥の傷害と比較して外傷誘導後の最初の10分間に海馬CA1領域で観察された。脳震盪の誘導中に、これは脳震盪よりも有意に重篤なラットのコアに傷害を生成するので、体重でカニューレに影響を与えることを避けてください。
この方法は、手順が異なる時点で同じ動物に繰り返すことができる近い頭部外傷であるため、繰り返し脳震盪の研究に適用することができます。
