Este método cria um paradigma para estudos futuros, fornecendo aos pesquisadores um modelo confiável e translacional de concussão que permite a caracterização longitudinal dos efeitos moleculares da concussão. Este modelo de rato combina microdiálise permitindo quantificação de analito contínuo com uma técnica de envoltório de cunha exercendo aceleração rápida e desaceleração da cabeça e torso que imita uma característica essencial do trauma craniocerebral humano. A implicação dessa técnica se estende aos estudos terapêuticos de concussão, pois oferece uma valiosa oportunidade para estudar o mecanismo e a eficácia dos agentes farmacológicos in vivo e ininterruptos.
É altamente recomendável trabalhar em equipes de dois durante as etapas de concussão e indução falsa deste método para restringir erros de manipulação e maximizar a eficiência durante o experimento. Demonstrando o procedimento será Chloe Provost, uma técnica em nosso laboratório. Para começar o procedimento, raspe a cabeça do animal usando um cortador elétrico.
Limpe a área raspada usando uma solução de 2% de álcool isopropílico e 2% de clorexidina gluconato três vezes. Em seguida, aplique pomada lubrificante para evitar o ressecamento durante a anestesia. Em seguida, coloque o rato em um aparelho estereotaxico.
Insira as barras de ouvido nos canais auditivos com muito cuidado e aperte o grampo do nariz. Depois, fixar uma cânula guia de aço inoxidável calibre 26 no braço do suporte no aparelho estereotaxista. Faça uma incisão de três centímetros no couro cabeludo.
Deixe o crânio limpo instalando quatro grampos ao redor da incisão. Raspe o periosteum firmemente do crânio com a lâmina cirúrgica até que as suturas bregma e lambda sejam visíveis. Se houver sangramento, mantenha a pressão firme no crânio com uma almofada de gaze ou aplicador de ponta de algodão.
Confirme se o crânio está corretamente alinhado no aparelho estereotaxico, comparando as coordenadas dorsoventral das suturas bregma e lambda. Identifique as coordenadas anteroposterior, mediolateral e dorsoventral da sutura bregma como pontos de referência para as coordenadas da cânula guia. Em seguida, tomando as coordenadas de sutura bregma como referências, calcule as coordenadas do local de implantação da cânula guia no hipocampo.
Marque o local de implantação preciso usando um marcador. Posteriormente, faça um furo com um diâmetro de 0,5 milímetros através do crânio no local alvo da cânula guia. Faça outros três furos de aproximadamente cinco milímetros ao redor deste ponto para enfiar três parafusos de ancoragem no crânio que solidificarão a cânula após a aplicação do cimento dentário acrílico.
Em seguida, insira a cânula no hipocampo e fixe-a com cimento dental. Tenha cuidado para não derramar cimento dentário em excesso ao redor do local onde o peso será descartado. Deixe o cimento secar por dois minutos e retire o braço do suporte da cânula.
Insira um obturador removível de aço inoxidável na cânula para evitar a infiltração de fluidos cerebrospinais e riscos de infecção. Depois, retire os quatro grampos, puxe a pele retraída e costure-a com um fio de sutura cirúrgica. Em seguida, remova o rato do aparelho e injete buprenorfina subcutânea para tratar a dor.
Coloque o roedor de volta em sua gaiola com uma almofada de aquecimento por baixo até que ele fique consciente. Em seguida, devolva-o ao centro de cuidados com animais por um período de recuperação de sete dias sob monitoramento próximo. Neste procedimento, remova o obturador da cânula e insira lentamente uma sonda de microdiálise.
Em seguida, fixar o conjunto da sonda em uma mola de aço inoxidável amarrada a um braço de alavanca de giratório líquido e contrabalancear com um suporte de anel e grampos para que o animal possa se mover livremente dentro de sua gaiola. Os ratos amarrados têm acesso a ad libitum a alimentos e água durante todo o procedimento de microdiálise. Use uma bomba de microinfusão para fornecer perfusato à sonda e coletar o dialise da linha de saída de sílica fundida.
Pelo menos uma hora e 30 minutos antes do procedimento começar, apareçam a sonda para sua taxa de fluxo de trabalho a um microliter por minuto. Verifique se a taxa de fluxo da sonda é consistente medindo o volume ao longo do tempo com uma pipeta. Posteriormente, colete cada amostra de dialise em um frasco de fração pré-carregado com um microliter de 0,25 mol por litro de ácido polemérico para evitar a degradação do analito.
Armazene a amostra a quatro graus Celsius para análise subsequente. Uma vez coletada a última amostra, remova a sonda de microdiálise da cânula e reinsera o obturador antes de devolver o rato ao centro de cuidados com animais. Para instalar o aparelho de concussão, tape uma folha de alumínio firmemente em uma estrutura de Plexiglass em forma de U que contém uma almofada de espuma.
Use uma lâmina afiada para fazer fendas na folha de alumínio. Fita a folha de alumínio ranhulada. Em seguida, posicione a estrutura do Plexiglass sob um tubo de guia de PVC.
Mantenha o tubo guia de PVC no lugar com um suporte de grampo a 3-1/2 centímetros acima do alumínio ranhurado. Conecte uma linha de pesca de mosca de nylon através da alça metálica de modo que a parte inferior do peso esteja em 2-1/2 centímetros sobre o alumínio ranhuado para evitar múltiplas batidas quando o rato está caindo na almofada de espuma após o impacto. Em seguida, conecte a linha de pesca de mosca de nylon ao suporte do grampo.
Puxe o peso através do tubo de PVC com a linha de pesca de mosca de nylon. Mantenha-o no lugar inserindo uma chave hexamica através dos furos preliminares perfurados em um metro acima da folha de alumínio ranhulada. Para induzir a concussão, coloque o animal em seu peito na folha de alumínio ranhulada para que sua cabeça esteja posicionada diretamente no caminho do peso do latão.
Retire o cone do nariz e puxe a chave hexa, ele. O peso cairá verticalmente através do tubo de PVC e impactará a cabeça do rato. Como resultado, o rato passará por uma rápida rotação de 180 graus e pousará de costas.
Retire o rato da almofada de espuma e coloque-o de costas na gaiola. Use um temporizador digital para medir o tempo de reflexo de direita como sinal de recuperação e gravidade da lesão. O tempo de reflexo de redoação é o tempo total do impacto até que o rato acorde e volte espontaneamente para a posição propensa ou comece a andar.
Note qualquer sinal de morte, fratura ou sangramento. Para indução falsa, coloque o animal em seu peito na folha de alumínio ranhulada para que sua cabeça fique diretamente no caminho do peso do latão. Retire o cone do nariz e, em seguida, remova o animal da folha de alumínio sem puxar a chave hexa.
Depois, coloque o rato de costas na gaiola. Use um temporizador digital para medir o tempo de recarmamento como um indicador de restauração neurológica. Os animais do grupo ferido tiveram um tempo de direito significativamente aumentado em média versus casos falsos e pareciam atordoados ao recuperar a consciência.
Dos 10 casos do grupo de concussão, apenas um animal apresentou pequenos sinais de sangramento sob o local de impacto após a queda de peso. Aumentos significativos nas concentrações extracelulares de glutamato foram observados na região do hipocampo CA1 durante os primeiros 10 minutos após a indução do trauma em comparação com a lesão falsa. Lembre-se durante a indução de concussão evite impactar a cânula com o peso, pois isso geraria lesões no núcleo do rato que são significativamente mais graves do que uma concussão.
Este método pode ser aplicado ao estudo de concussões repetidas, uma vez que o procedimento é uma lesão na cabeça próxima que pode ser repetida nos mesmos animais em diferentes momentos.
