Questo metodo crea un paradigma per studi futuri fornendo ai ricercatori un modello affidabile e trascizionale di commozione cerebrale che consente la caratterizzazione longitudinale degli effetti molecolari della commozione cerebrale. Questo modello di ratto combina la microdialisi che consente la quantificazione continua dell'analita con una tecnica di avvolgimento del cuneo che esercita una rapida accelerazione e decelerazione della testa e del busto che imita una caratteristica essenziale del trauma craniocerebrale umano. L'implicazione di questa tecnica si estende verso studi terapeutici di commozione cerebrale in quanto offre una preziosa opportunità per studiare il meccanismo e l'efficacia degli agenti farmacologici in vivo e ininterrotti.
Si consiglia vivamente di lavorare in team di due durante le fasi di commozione cerebrale e induzione fittizia di questo metodo per limitare gli errori di manipolazione e massimizzare l'efficienza durante l'esperimento. A dimostrare la procedura sarà Chloe Provost, una tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare la procedura, radere la testa dell'animale usando un clipper elettrico.
Pulire l'area rasata utilizzando una soluzione di alcol isopropile al 2% e 2% di clorexidina gluconato tre volte. Quindi applicare unguento oculare lubrificante per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Quindi, posizionare il topo in un apparato stereotassico.
Inserire le barre dell'orecchio nei canali uditori con grande cura e stringere il morsetto del naso. Successivamente, fissare una cannula guida in acciaio inossidabile calibro 26 al braccio portante sull'apparato stereotassico. Fai un'incisione della linea mediana di tre centimetri sul cuoio capelluto.
Lasciare libero il cranio installando quattro morsetti intorno all'incisione. Raschiare saldamente il periostio dal cranio con la lama chirurgica fino a quando le suture bregma e lambda sono visibili. Se c'è sanguinamento, mantenere una pressione ferma sul cranio con un cuscinetto di garza o un applicatore con punta di cotone.
Verificare se il cranio è correttamente allineato sull'apparato stereotassico confrontando le coordinate dorsoventrali delle suture bregma e lambda. Identificare le coordinate anteroposterior, mediolaterali e dorsoventrali della sutura bregma come punti di riferimento per le coordinate della cannula guida. Quindi prendendo le coordinate della sutura bregma come riferimenti, calcola le coordinate del sito di impianto della cannula guida nell'ippocampo.
Contrassegnare il sito di impianto preciso utilizzando un marcatore. Successivamente, praticare un foro con un diametro di 0,5 millimetri attraverso il cranio nel sito di destinazione della cannula guida. Praticare altri tre fori di circa cinque millimetri intorno a questo punto per infilare tre viti di ancoraggio nel cranio che solidificheranno la cannula dopo l'applicazione del cemento dentale acrilico.
Quindi, inserire la cannula nell'ippocampo e fissarla con cemento dentale. Fare attenzione a non versare cemento dentale in eccesso intorno al sito in cui il peso verrà lasciato cadere. Lasciare asciugare il cemento per due minuti, quindi rimuovere il braccio portante dalla cannula.
Inserire un otturatore rimovibile in acciaio inossidabile nella cannula per evitare infiltrazioni di liquidi cerebrospinali e rischi di infezione. Successivamente, rimuovere i quattro morsetti, tirare indietro la pelle retrattile e cucirla con un filo di sutura chirurgica. Quindi, rimuovere il topo dall'apparato e iniettare Buprenorfina per via sottocutanea per trattare il dolore.
Riposizionare il roditore nella sua gabbia con una pastiglia di riscaldamento sotto fino a quando non diventa cosciente. Quindi restituirlo alla struttura di cura degli animali per un periodo di recupero di sette giorni sotto stretto monitoraggio. In questa procedura, rimuovere l'otturatore dalla cannula e inserire lentamente una sonda di microdialisi.
Successivamente, fissare il gruppo sonda a una molla in acciaio inossidabile legati a un braccio girevole liquido e controbilanciare la leva con un supporto ad anello e morsetti in modo che l'animale possa muoversi liberamente all'interno della sua gabbia. I ratti tethered hanno accesso ad libitum al cibo e all'acqua durante l'intera procedura di microdialisi. Utilizzare una pompa a microinfusione per fornire perfusato alla sonda e raccogliere il dialisato dalla linea di uscita della silice fusa.
Almeno un'ora e 30 minuti prima dell'inizio della procedura, alzare la sonda alla sua portata di lavoro a un microlitro al minuto. Verificare che la portata della sonda sia coerente misurando il volume nel tempo con una pipetta. Successivamente, raccogliere ogni campione di dialisato in una fiala frazionata precaricata con un microlitro di 0,25 mole per litro di acido perclorico per prevenire la degradazione dell'anale.
Conservare il campione a quattro gradi Celsius per un'analisi successiva. Una volta raccolto l'ultimo campione, rimuovere la sonda di microdialisi dalla cannula e reinserire l'otturatore prima di riportare il topo nella struttura di cura degli animali. Per installare l'apparato di commozione cerebrale, rastremi saldamente un foglio di alluminio su un telaio in plexiglass a forma di U che contiene un cuscino in schiuma.
Utilizzare una lama affilata per realizzare fessure nel foglio di alluminio. Nastro il foglio di alluminio fessurato. Quindi posizionare il telaio in plexiglass sotto un tubo guida in PVC.
Tenere il tubo guida in PVC in posizione con un supporto per morsetto a 3-1/2 centimetri sopra l'alluminio fessurato. Attaccare una lente di pesca a mosca di nylon attraverso l'anello metallico in modo che il fondo del peso sia a 2-1/2 centimetri sopra l'alluminio fessurato per evitare più colpi quando il topo cade sul cuscino di schiuma in seguito all'impatto. Quindi attaccare la lentura di pesca a mosca in nylon al supporto del morsetto.
Accostare il peso attraverso il tubo in PVC con la lena da pesca a mosca in nylon. Tenerlo in posizione inserendo una chiave esagonale attraverso i fori preliminari praticati a un metro sopra il foglio di alluminio fessurato. Per indurre commozione cerebrale, posizionare l'animale sul petto sul foglio di alluminio fessurato in modo che la sua testa sia posizionata direttamente nel percorso del peso in ottone.
Rimuovere il cono del naso e tirare il tasto esagonale. Il peso cadrà verticalmente attraverso il tubo in PVC e avrà un impatto sulla testa del topo. Di conseguenza, il topo subirà una rapida rotazione di 180 gradi e atterrerà sulla schiena.
Rimuovere il topo dal cuscino di schiuma e posizionarlo sulla schiena nella gabbia. Usa un timer digitale per misurare il tempo riflesso di destra come segno di recupero e gravità delle lesioni. Il tempo riflesso di destra è il tempo totale dall'impatto fino a quando il topo non si sveglia e torna spontaneamente nella posizione incline o inizia a camminare.
Si notino segni di morte, frattura o sanguinamento. Per l'induzione fittizia, posizionare l'animale sul petto sul foglio di alluminio fessurato in modo che la sua testa si sdrai direttamente sul percorso del peso in ottone. Rimuovere il cono del naso e quindi rimuovere l'animale dal foglio di alluminio senza tirare il tasto esagonale.
Successivamente, metti il topo sulla schiena nella gabbia. Utilizzare un timer digitale per misurare il tempo di applicazione come indicatore di ripristino neurologico. Gli animali del gruppo ferito hanno avuto un tempo di giustitaggio significativamente aumentato in media rispetto ai casi fittizi e sono apparsi storditi dopo aver ripreso conoscenza.
Dei 10 casi del gruppo di commozione cerebrale, solo un animale ha mostrato lievi segni di sanguinamento sotto il sito di impatto dopo la caduta di peso. Aumenti significativi delle concentrazioni extracellulari di glutammato sono stati osservati nella regione ippocampale CA1 durante i primi 10 minuti successivi all'induzione del trauma rispetto alla lesione fittizia. Si prega di ricordare durante l'induzione della commozione cerebrale evitare di impaggiare la cannula con il peso in quanto ciò genererebbe lesioni al nucleo del topo che sono significativamente più gravi di una commozione cerebrale.
Questo metodo può essere applicato allo studio di commozioni cerebrali ripetute poiché la procedura è una lesione alla testa stretta che può essere ripetuta sugli stessi animali in diversi punti di tempo.
