Falta una comprensión completa del papel que juegan las células M en la homeostasis intestinal y la defensa inmune, debido a la rareza de las células M en el intestino. La diferenciación inducida de células M en cultivos derivados de células madre intestinales humanas permitirá el estudio del desarrollo y las funciones de las células M. Para recubrir las membranas Transwell, coloque el número deseado de Transwells en una placa de 24 pozos, creando un sistema de dos cámaras.
Diluir la matriz extracelular, o ECM, 25 veces en solución salina tamponada de fosfato estéril frío. A continuación, agregue 100 microlitros de solución diluida en frío en cada cámara superior sobre la membrana. Cubra la placa de 24 pozos con una tapa y coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejido a 37 grados Celsius durante dos horas para permitir la solidificación de ECM en la membrana.
Después de dos horas, retire la placa de la incubadora y colóquela en una capucha de cultivo de tejido. Con pinzas estériles, invierta cada Transwell para eliminar suavemente la solución restante. Deje que las membranas se sequen al aire en la campana con la tapa abierta mientras se recogen las células.
Retire la placa de enteroides ileales de la incubadora y retire suavemente los medios de cultivo de cada pozo por aspiración al vacío o con una pipeta. Para romper el ECM, agregue 500 microlitros de hielo frío 0,5 EDTA milimétrico a cada pozo que contenga enteroides ileales suspendidos en ECM. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente con una pipeta P1000 en 500 microlitros para romper ECM, liberando así enteroides ileales en la solución.
Recoger la solución de cada pozo en tubos cónicos de 15 mililitros. Pele las células en una centrífuga a 140G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. El pellet debe ser visible, pero se puede desalojar fácilmente, así que retire lentamente el sobrenadante por aspiración al vacío o con una pipeta.
Para digerir los enlaces de unión estrechos y dividir los enteroides ileales en células individuales, resuspender el pellet en 500 microlitros de tripina a temperatura ambiente por cada cinco pozos recogidos. Usando una pipeta P1000, pipetear hacia arriba y hacia abajo para desagregar los grumos. Incubar los tubos en un baño de agua celsius de 37 grados durante cinco minutos o menos.
Añadir un mililitro de DMEM F-12 avanzado con 10%FPS por 500 microlitros de tripina para inactivar la tripina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con un conjunto P1000 en 500 microlitros al menos 50 veces contra el lado del tubo cónico para desagregar aún más los grumos restantes en células individuales. Coloque un colador celular de 40 micras sobre un tubo cónico de 50 mililitros y agregue un mililitro de DMEM F-12 avanzado con 10%FPS para mojar el colador celular.
Pipetear la suspensión de una sola célula del cónico de 15 mililitros sobre el colador. Lave el colador con un mililitro de DMEM F-12 avanzado con 10%FPS. Transfiera las células que pasaron por el colador celular desde el tubo cónico de 50 mililitros a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
Cuente las células usando un hemocicómetro. Centrifugar las células en el nuevo tubo de 15 mililitros a 400G durante cinco minutos a temperatura ambiente. El pellet celular debe ser visible.
Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta, de nuevo salvando el sobrenadante en caso de que el pellet se desalojar. Resuspender el pellet celular en MCMGF plus con 10 micromolares Y27632. Asegúrese de que las membranas codificadas ecM se hayan secado completamente según lo evaluado a simple vista.
Lave la cámara superior con 200 microlitros de MCMGF plus. A continuación, agregue 200 microlitros de solución celular en cada cámara superior. Añadir 700 microlitros de MCMGF plus con 10 micromolares Y27632 a cada cámara inferior.
Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejido de 37 grados Celsius con 5%CO2. Después de un día de crecimiento, retire el medio de la cámara superior y sustitúyalos con 200 microlitros de MCMGF fresco más para evitar el crecimiento de múltiples capas celulares. Una vez que los monocapas son aproximadamente 80%confluentes, generalmente entre los días uno a tres después de la siembra, reemplace los medios basilaterales con medios de diferenciación para pozos de control, o con medios celulares M para pozos de inducción de células M.
Sustituya el soporte de la cámara superior por un medio de diferenciación para ambas condiciones. Para verificar la diferenciación de células M por QRTPCR, primero retire el medio de las cámaras superior e inferior. Lave suavemente la cámara superior dos veces con 300 microlitros de PPS a temperatura ambiente.
Añadir 300 microlitros de TRIzol a cada cámara superior, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Mientras tanto, etiqueta los tubos de micro centrífuga para cada pozo, y añade 700 microlitros de TRIzol a cada tubo. Recoger el homogeneizar celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces con un P1000, y transferir el contenido a los tubos de micro centrífuga correspondientes.
Vórtice durante cinco segundos para mezclar. Mantenga las muestras a temperatura ambiente durante tres minutos adicionales y, a continuación, continúe con los protocolos QRTPCR estándar, o almacene muestras a 80 grados centígrados negativos. Para verificar la diferenciación de células M por inmunofluorescencia, primero, retire el medio de la cámara superior.
Lavar suavemente dos veces con 300 microlitros de temperatura ambiente PBS. Añadir 100 microlitros de temperatura ambiente 4%PFA en PBS a la cámara superior. Cubra la placa con papel de aluminio y deje reposar durante 25 minutos a temperatura ambiente.
Después de retirar el PFA, lave la cámara superior tres veces con 300 microlitros de temperatura ambiente PBS. Incubar las monocapas con 100 microlitros de 5%BSA disueltos en PBS durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente para bloquear las monocapas antes de retirar la solución. Preparar la solución de anticuerpos primarios GP2 en un uno por ciento de BSA en PBS a una dilución de uno a 100, y añadir 100 microlitros por pozo.
Manchar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad, antes de retirar la solución. Lave la cámara superior tres veces con 300 microlitros de temperatura ambiente PBS. Preparar una solución de tinción secundaria de cabra con etiqueta fluorescente anti-ratón IgG faloideína y DAPI, y añadir 100 microlitros por pozo.
Mancha durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave los pozos tres veces con 300 microlitros de PBS. A continuación, coloque una gota de cinco microlitros de solución de montaje en un portaobjetos de vidrio.
Retire el pozo de la placa de 24 pozos e invierta. Durante la extracción de la membrana del Transwell, la membrana debe permanecer completamente plana. Los golpes en la membrana evitan un sello firme en el portaobjetos de vidrio, y pueden afectar en gran medida la calidad de la imagen.
Para asegurar el éxito, corte cuidadosamente la membrana del pozo usando un bisturí afilado. Coloque la membrana con las células mirando hacia arriba sobre la gota de la solución de montaje en el portaobjetos de vidrio. Agregue 10 microlitros de solución de montaje en la parte superior y central de la membrana, y coloque un resbalón de cubierta en la parte superior para sellar la membrana entre el portaobjetos de vidrio y el deslizamiento de la cubierta.
Seque los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 24 horas. Las células M son detectadas por expresión superficial de GP2 por inmunofluorescentes. Típicamente, en una monocapa confluente, una a cinco células M se observan en un campo de microscopio dado en aumento de 40X por días seis a ocho post siembra en muestras tratadas con RANKL y TNF alfa.
No se ve ninguna expresión GP2 en las muestras no tratadas. La vista ortogonal del plano XZ superpuesta con una sonda de faloide muestra las estructuras de actina que rodean cada celda, y la expresión GP2 en la superficie apical de las células M. Este modelo recapitula la baja frecuencia de las células M que se encuentran en el intestino humano.
Para determinar si las células M desarrolladas en este modelo son capaces de unirse a IgA, la presencia de IgA en las células M se visualiza utilizando un anticuerpo secundario conjugado con flúor que reconoce la cadena pesada de IgA sérica humana. Las células M tratadas con IgA durante una hora tienen IgA unida a la superficie apical, mientras que las células M en pozos de control que solo fueron tratadas con el anticuerpo secundario a IgA, no tienen señal detectable. Además, IgA se une específicamente a la superficie apical de las células M, y no se encuentra unido a ninguna célula que carezca de mancha superficial GP2.
Además, las células M tienen característicamente más corta actina densa en su superficie apical. Cambiar a rankL TNF alfa suplementado medios de diferenciación cuando las monocapas son alrededor 80%confluente, es clave para lograr una buena diferenciación de células M. Esta técnica permitirá a los investigadores explorar cuestiones relacionadas con el desarrollo de células M, así como interacciones de patógenos del huésped y estudios de transporte de fármacos que involucran células M.
